Unik metod för att isolera neutrofiler i råttbenmärg med jämförbar kapacitet
Summary
Denna forskning beskriver två tekniker för att isolera rikligt med neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Den ena metoden kombinerar ett kommersiellt neutrofilisoleringskit med densitetsgradientcentrifugering, medan den andra endast använder densitetsgradientcentrifugering. Båda metoderna ger funktionella NET som överträffar dem från neutrofiler i perifert blod.
Abstract
Det primära syftet med denna forskning var att utveckla ett tillförlitligt och effektivt tillvägagångssätt för att isolera neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Detta försök uppstod på grund av begränsningar i samband med den traditionella metoden att extrahera NET från perifert blod, främst på grund av bristen på tillgängliga neutrofiler för isolering. Studien avslöjade två distinkta metoder för att erhålla neutrofiler från råttor från benmärg: en strömlinjeformad enstegsprocedur som gav tillfredsställande reningsnivåer och en mer tidskrävande tvåstegsprocess som uppvisade förbättrad reningseffektivitet. Viktigt är att båda teknikerna gav en betydande mängd livskraftiga neutrofiler, mellan 50 och 100 miljoner per råtta. Denna effektivitet speglade de resultat som erhölls genom att isolera neutrofiler från både humana och murina källor. Signifikant är att neutrofiler som härrör från benmärg från råtta uppvisade jämförbar förmåga att utsöndra NET jämfört med neutrofiler erhållna från perifert blod. Den benmärgsbaserade metoden gav dock genomgående betydligt större mängder av både neutrofiler och NET. Detta tillvägagångssätt visade potentialen att erhålla betydligt större mängder av dessa cellulära komponenter för ytterligare nedströmsapplikationer. Noterbart är att dessa isolerade NET och neutrofiler är lovande för en rad tillämpningar, som spänner över områdena inflammation, infektion och autoimmuna sjukdomar.
Introduction
Neutrofiler utgör en kritisk undergrupp av leukocyter som spelar en central roll i det medfödda immunsvaret. De karakteriseras av flerflikiga kärnor och granuler som innehåller olika proteaser och antimikrobiella peptider1. Neutrofiler fungerar främst genom degranulering, fagocytos och bildning av NET. Observationen av NET gjordes först av Takei et al. 1996 under ett experiment där neutrofiler stimulerades med forbolmyristatacetat (PMA)2. Därefter myntades processen för NET-bildning “NETosis” av Brinkmann et al.3 2004. Deras forskning belyste ytterligare den avgörande roll som NET spelar i neutrofilmedierade antimikrobiella svar. NET är nätliknande strukturer som består av kromatin, histoner och antimikrobiella proteiner som frisätts från aktiverade neutrofiler som svar på infektiösa och inflammatoriska stimuli. NET kan immobilisera och döda invaderande patogener genom att fånga dem och utsätta dem för en hög koncentration av antimikrobiella peptider och proteaser 1,3. Dessutom bidrar NET till eliminering av apoptotiska celler och deltar i inflammationsupplösning. Nyligen genomförda studier tyder också på att en överdriven bildning av NET eller försämrad NET-nedbrytning kan leda till vävnadsskador, autoimmuna sjukdomar, trombogenes och försämrad revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
Den patogena rollen av NET vid okontrollerad fibros efter hjärtinfarkt och bildandet av ventrikulära aneurysm har påvisats genom expansion av perivaskulär fibros 4,11. Hjärtinfarktmodellen och isoleringen av neutrofiler från benmärg hos möss är båda väletablerade. Polymorfonukleära (PMN) leukocyter, en typ av vita blodkroppar som finns rikligt i humant blod, fungerar som en utmärkt källa för att isolera humana neutrofiler. Denna metod eliminerar behovet av att skörda benmärg, vilket ökar säkerheten och effektiviteten.
NET spelar också en roll vid förmaksflimmer i samband med hjärtombyggnad. Stora djur som hundar och grisar användes dock för att modellera förmaksflimmer, eftersom möss saknar ett förmak som är tillräckligt stort för att etablera en återinträdescykel eller AF-modellen, såvida inte specifika jonkanaler eller signalvägar slås ner eller slås ut12. Även om det är möjligt att inducera förmaksflimmer hos råttor och isolera neutrofiler från perifert blod från råttor som tidigare beskrivits, stötte forskarna på en begränsning där endast 2 x 105-5 x 105 neutrofiler kunde isoleras från perifert blod (10 ml per råtta). Att extrahera tillräckligt med NET vid varje tidpunkt krävde cirka 10-25 råttor (5 x 106 neutrofiler totalt), vilket resulterade i en tidskrävande, dyr och ofta lågavkastande process13. I detta avseende presenterar Li He och kollegor en benmärgsorienterad strategi för att få adekvata NET från råttor14. I sin artikel ger de en omfattande beskrivning av isolering av neutrofiler från benmärg från råtta och jämför NET-sekretionsförmågan hos perifera neutrofiler och benmärgsneutrofiler hos råttor. De två metoder som beskrivs tillgodoser olika experimentella mål, som båda resulterar i tillräckliga mängder neutrofiler från råttbenmärg samtidigt som antalet råttor som krävs minskar. Tvåstegsisoleringsmetoden visade överlägsen rening av neutrofila granulocyter, medan enstegsmetoden visade sig vara tidseffektiv med acceptabla reningsnivåer. Dessutom jämförde forskarna NETosis och NET-bildning mellan neutrofiler i benmärg hos råttor och deras perifera motsvarigheter, och fann samma styrka som PMN. Dessa fynd bidrar i hög grad till neutrofilrelaterade studier av förmaksflimmer och understryker vikten av att flexibelt välja olika källor för neutrofilisolering i olika försöksdjur med olika neutrofilfördelningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering av neutrofiler utgör ett avgörande steg i studien av NETosis, där valet av en lämplig isoleringsmetod är av största vikt för att uppnå tillförlitliga resultat. En viktig faktor att väga in är förekomsten av lymfocytkontamination under isoleringen. Att ta itu med denna utmaning är särskilt viktigt när man isolerar neutrofiler från råttor från benmärg. Trots det distinkta densitetsintervallet för neutrofiler (1,0814-1,0919, med en topp på 1,0919) jämfört med lymfocyter (1,0337-1,0765, med e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering: Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 82004154, 81900311, 82100336 och 81970345).
Materials
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn’s and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
