Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice

Summary

Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .

Abstract

L’encapsulation tridimensionnelle (3D) des sphéroïdes est cruciale pour reproduire correctement le microenvironnement tumoral pour une croissance cellulaire optimale. Ici, nous avons conçu un modèle de glioblastome 3D in vitro pour l’encapsulation de sphéroïdes afin d’imiter le microenvironnement extracellulaire de la tumeur. Tout d’abord, nous avons formé des moules pyramidaux carrés à micropuits en utilisant du polydiméthylsiloxane. Ces moules à micropuits ont ensuite été utilisés pour fabriquer des sphéroïdes tumoraux avec des tailles étroitement contrôlées de 50 à 500 μm. Une fois les sphéroïdes formés, ils ont été récoltés et encapsulés dans des hydrogels à base de polyéthylène glycol (PEG). Les hydrogels PEG constituent une plate-forme polyvalente pour l’encapsulation de sphéroïdes, car les propriétés de l’hydrogel telles que la rigidité, la dégradabilité et l’adhérence cellulaire peuvent être ajustées indépendamment. Ici, nous avons utilisé un hydrogel souple représentatif (~8 kPa) pour encapsuler les sphéroïdes de glioblastome. Enfin, une méthode de coloration et d’imagerie des sphéroïdes a été développée pour obtenir des images de haute qualité par microscopie confocale. En raison du noyau sphéroïde dense et de la périphérie relativement clairsemée, l’imagerie peut être difficile, mais l’utilisation d’une solution de dégagement et d’un sectionnement optique confocal permet d’atténuer ces difficultés d’imagerie. En résumé, nous montrons une méthode pour fabriquer des sphéroïdes uniformes, les encapsuler dans des hydrogels PEG et effectuer une microscopie confocale sur les sphéroïdes encapsulés pour étudier la croissance des sphéroïdes et diverses interactions cellule-matrice.

Introduction

Les sphéroïdes tumoraux sont apparus comme des outils in vitro utiles dans l’étude de l’étiologie du cancer, de la pathologie et de la réponse aux médicaments¹. Traditionnellement, les sphéroïdes ont été cultivés dans des conditions telles que des plaques à faible adhérence ou des bioréacteurs, où l’adhésion cellule-cellule est privilégiée par rapport à l’adhésion cellule-surface². Cependant, il est maintenant reconnu que pour récapituler plus fidèlement le microenvironnement tumoral, les modèles sphéroïdes in vitro devraient capturer à la fois les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Cela a....

Protocol

1. Préparation des solutions

1. Préparation d’une solution de précurseur de polydiméthylsiloxane (PDMS)
   1. Préparez la solution de précurseur PDMS négatif (également utilisée pour la solution de précurseur de colle). Ramassez l’élastomère dans un bateau de pesée à l’aide d’une spatule et pesez-le. Ajouter l’agent de durcissement à la base en élastomère dans un rapport de 1:10. Mélangez doucement et soigneusement le PDMS et le produit de durcissement à l’aide de la spatule dans le bateau de pesée en plastique.
      REMARQUE : Cette solution précurseur PDMS est versée dans la plaque pyramidale carrée à micropuits à 6 puits pour former le moule ....

Results

Les plateformes de criblage de médicaments à base de sphéroïdes pour étudier les effets chimiothérapeutiques sont de plus en plus recherchées en raison de l’accent mis sur la modulation du microenvironnement tumoral lors de l’encapsulation des sphéroïdes dans des biomatériaux répliquant les tissus natifs. Ici, nous avons développé une méthode pour la préparation de sphéroïdes tumoraux multicellulaires et l’encapsulation et l’imagerie ultérieures dans un hydrogel 3D. Les sphéroïdes sont préparés dans des moules à micropui.......

Discussion

Des modèles de sphéroïdes tumoraux multicellulaires à base d’hydrogel sont de plus en plus développés pour faire progresser les découvertes thérapeutiques contre le cancer 11,13,29. Ils sont bénéfiques car ils émulent les paramètres clés du microenvironnement tumoral de manière contrôlée et, malgré leur complexité, sont plus simples et moins chers à utiliser que les modèles in vivo, et beaucoup sont compatibles avec les technolo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 % d’éthanol	Fisher Scientific  ;	LC22210-4
15 mL Coniques	FALCON	352097
Plaque à 24 puits Plaques de fixation ultra basses	Fisher Scientific	07-200-602
Boîte de Pétri 35 mm Amazon		706011
4 bras poly(éthylène glycol)-acrylate (4 bras PEG-Ac ; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Coniques	Fisher Scinetific
AggreWell 400 à 6 puits.	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Micropuits pyramidaux carrés  ;
solution de rinçage anti-adhérence	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat # : 07010
Acide aspartique-Arginine-Cystéine-Glycine-Valine-Proline-Méthionine-Sérine-Méthionine-Arginine-Glycine-Cystine-Arginine-Acide Aspartique (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, Chine	n/a
Hotte chimique	KEWAUNEE	99151
Matrice de membrane basale Corning Matrigel, sans LDEV  ;	Corning	356234	Matrice de membrane basale
Détergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Tensioactif non ionique
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Fisher Scientific  ;	BP231-100
Pipettes jetables (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL : 13-678-11B, 2 mL : 05214038, 5 mL (FALCON) : 357529, 10 mL : 13-678-11E, 25 mL : 13-678-11, 50 ml : 13-678-11F
Sérum fœtal bovin	HyClone	SH30073-03
Formaldéhyde 37 % Solution	Sigma Aldrich	F1635
Plaques de verre	Slumpys	GBS4100SFSL
Pipettes de transfert en verre	Fisher Scinetific	5 3/4 » : 1367820A, 9 » :136786B
Glycine-Arginine-Cystéine-Acide Aspartique-Arginine-Glycine-Acide Aspartique-Sérine (GRCD-RGDS) Peptide	Genic Bio, Shanghai, Chine	n/a	Synthèse personnalisée
Hémacytomètre	Bright-Line	383684
Solution hydrophobe - Repel Silane  ;	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubateur	NUAIRE	NU-8500
Microscope inversé (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific  ;	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Microscope optique et fluorescent (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro tubes à centrifuger	Fisher Scientific	2 mL : 02681258
Logiciel de microscope	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  ;	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM  ;	PM992
PBS (1x), pH 7,4	HyClone	SH30256,01
Pénicilline Streptomycine	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pointes de pipette (1&ndash ; 200 et micro ; L, 101&ndash ; 1000 et micro ; L)	Fisher Scinetific	2707509
Pipettes de transfert jetables en plastique standard	Fisher Scientific	13-711-9D
(100 mL)	Amazon  ;	mdo-azoc-1030
poly(éthylène glycol)-dithiol (PEG-diSH ; 3,4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydiméhylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydiméthylsiloxane
Gants d’examen non poudrés	Quest	92897
Iodure de propidium, 1 mg/mL de sol aqueux.	Fisher Scientific  ;
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Entretoises en silicone - Feuille de silicone, 0,5 mm d’épaisseur/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  ;	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Capot de culture tissulaire	NUAIRE	NU-425-600
Triéthanolamine, &ge ; 99,0 % (GC)  ;	Sigma Aldrich	90279
U-87 MG cellules de glioblastome humain	American Type Culture Collection  ;	HTB-14