Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .
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Article de méthode
Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’encapsulation tridimensionnelle (3D) des sphéroïdes est cruciale pour reproduire correctement le microenvironnement tumoral pour une croissance cellulaire optimale. Ici, nous avons conçu un modèle de glioblastome 3D in vitro pour l’encapsulation de sphéroïdes afin d’imiter le microenvironnement extracellulaire de la tumeur. Tout d’abord, nous avons formé des moules pyramidaux carrés à micropuits en utilisant du polydiméthylsiloxane. Ces moules à micropuits ont ensuite été utilisés pour fabriquer des sphéroïdes tumoraux avec des tailles étroitement contrôlées de 50 à 500 μm. Une fois les sphéroïdes formés, ils ont été récoltés et encapsulés dans des hydrogels à base de polyéthylène glycol (PEG). Les hydrogels PEG constituent une plate-forme polyvalente pour l’encapsulation de sphéroïdes, car les propriétés de l’hydrogel telles que la rigidité, la dégradabilité et l’adhérence cellulaire peuvent être ajustées indépendamment. Ici, nous avons utilisé un hydrogel souple représentatif (~8 kPa) pour encapsuler les sphéroïdes de glioblastome. Enfin, une méthode de coloration et d’imagerie des sphéroïdes a été développée pour obtenir des images de haute qualité par microscopie confocale. En raison du noyau sphéroïde dense et de la périphérie relativement clairsemée, l’imagerie peut être difficile, mais l’utilisation d’une solution de dégagement et d’un sectionnement optique confocal permet d’atténuer ces difficultés d’imagerie. En résumé, nous montrons une méthode pour fabriquer des sphéroïdes uniformes, les encapsuler dans des hydrogels PEG et effectuer une microscopie confocale sur les sphéroïdes encapsulés pour étudier la croissance des sphéroïdes et diverses interactions cellule-matrice.
Introduction
Les sphéroïdes tumoraux sont apparus comme des outils in vitro utiles dans l’étude de l’étiologie du cancer, de la pathologie et de la réponse aux médicaments1. Traditionnellement, les sphéroïdes ont été cultivés dans des conditions telles que des plaques à faible adhérence ou des bioréacteurs, où l’adhésion cellule-cellule est privilégiée par rapport à l’adhésion cellule-surface2. Cependant, il est maintenant reconnu que pour récapituler plus fidèlement le microenvironnement tumoral, les modèles sphéroïdes in vitro devraient capturer à la fois les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Cela a....
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Protocole
1. Préparation des solutions
- Préparation d’une solution de précurseur de polydiméthylsiloxane (PDMS)
- Préparez la solution de précurseur PDMS négatif (également utilisée pour la solution de précurseur de colle). Ramassez l’élastomère dans un bateau de pesée à l’aide d’une spatule et pesez-le. Ajouter l’agent de durcissement à la base en élastomère dans un rapport de 1:10. Mélangez doucement et soigneusement le PDMS et le produit de durcissement à l’aide de la spatule dans le bateau de pesée en plastique.
REMARQUE : Cette solution précurseur PDMS est versée dans la plaque pyramidale carrée à micropuits à 6 puits pour former le moule ....
- Préparez la solution de précurseur PDMS négatif (également utilisée pour la solution de précurseur de colle). Ramassez l’élastomère dans un bateau de pesée à l’aide d’une spatule et pesez-le. Ajouter l’agent de durcissement à la base en élastomère dans un rapport de 1:10. Mélangez doucement et soigneusement le PDMS et le produit de durcissement à l’aide de la spatule dans le bateau de pesée en plastique.
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Résultats
Les plateformes de criblage de médicaments à base de sphéroïdes pour étudier les effets chimiothérapeutiques sont de plus en plus recherchées en raison de l’accent mis sur la modulation du microenvironnement tumoral lors de l’encapsulation des sphéroïdes dans des biomatériaux répliquant les tissus natifs. Ici, nous avons développé une méthode pour la préparation de sphéroïdes tumoraux multicellulaires et l’encapsulation et l’imagerie ultérieures dans un hydrogel 3D. Les sphéroïdes sont préparés dans des moules à micropui.......
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Discussion
Des modèles de sphéroïdes tumoraux multicellulaires à base d’hydrogel sont de plus en plus développés pour faire progresser les découvertes thérapeutiques contre le cancer 11,13,29. Ils sont bénéfiques car ils émulent les paramètres clés du microenvironnement tumoral de manière contrôlée et, malgré leur complexité, sont plus simples et moins chers à utiliser que les modèles in vivo, et beaucoup sont compatibles avec les technolo.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par des fonds de démarrage fournis au Dr Silviya P Zustiak par l’Université de Saint Louis ainsi que par une subvention de démarrage du Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience de l’Université de Saint Louis accordée au Dr Silviya P Zustiak.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 70 % d’éthanol | Fisher Scientific ; | LC22210-4 | |
| 15 mL Coniques | FALCON | 352097 | |
| Plaque à 24 puits Plaques de fixation ultra basses | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Boîte de Pétri 35 mm Amazon | 706011 | ||
| 4 bras poly(éthylène glycol)-acrylate (4 bras PEG-Ac ; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Coniques | Fisher Scinetific | ||
| AggreWell 400 à 6 puits. | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Micropuits pyramidaux carrés ; |
| solution de rinçage anti-adhérence | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat # : 07010 | |
| Acide aspartique-Arginine-Cystéine-Glycine-Valine-Proline-Méthionine-Sérine-Méthionine-Arginine-Glycine-Cystine-Arginine-Acide Aspartique (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, Chine | n/a | |
| Hotte chimique | KEWAUNEE | 99151 | |
| Matrice de membrane basale Corning Matrigel, sans LDEV ; | Corning | 356234 | Matrice de membrane basale |
| Détergent - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Tensioactif non ionique |
| Diméthyl sulfoxyde (DMSO) | Fisher Scientific ; | BP231-100 | |
| Pipettes jetables (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL : 13-678-11B, 2 mL : 05214038, 5 mL (FALCON) : 357529, 10 mL : 13-678-11E, 25 mL : 13-678-11, 50 ml : 13-678-11F | |
| Sérum fœtal bovin | HyClone | SH30073-03 | |
| Formaldéhyde 37 % Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Plaques de verre | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| Pipettes de transfert en verre | Fisher Scinetific | 5 3/4 » : 1367820A, 9 » :136786B | |
| Glycine-Arginine-Cystéine-Acide Aspartique-Arginine-Glycine-Acide Aspartique-Sérine (GRCD-RGDS) Peptide | Genic Bio, Shanghai, Chine | n/a | Synthèse personnalisée |
| Hémacytomètre | Bright-Line | 383684 | |
| Solution hydrophobe - Repel Silane ; | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| Incubateur | NUAIRE | NU-8500 | |
| Microscope inversé (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific ; | D1125 | |
| Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Microscope optique et fluorescent (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro tubes à centrifuger | Fisher Scientific | 2 mL : 02681258 | |
| Logiciel de microscope | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 ; | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm | PARAFILM ; | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7,4 | HyClone | SH30256,01 | |
| Pénicilline Streptomycine | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Pointes de pipette (1&ndash ; 200 et micro ; L, 101&ndash ; 1000 et micro ; L) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Pipettes de transfert jetables en plastique standard | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| (100 mL) | Amazon ; | mdo-azoc-1030 | |
| poly(éthylène glycol)-dithiol (PEG-diSH ; 3,4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| Polydiméhylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydiméthylsiloxane |
| Gants d’examen non poudrés | Quest | 92897 | |
| Iodure de propidium, 1 mg/mL de sol aqueux. | Fisher Scientific ; | ||
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Entretoises en silicone - Feuille de silicone, 0,5 mm d’épaisseur/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 ; | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| Capot de culture tissulaire | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Triéthanolamine, &ge ; 99,0 % (GC) ; | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG cellules de glioblastome humain | American Type Culture Collection ; | HTB-14 |
Références
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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Réimpressions et autorisations
