Estrategias de cuantificación, evaluación de viabilidad y visualización de biopelículas de Acinetobacter
Summary
Este protocolo describe la preparación del inóculo, la cuantificación de la biopelícula en placas de microtitulación utilizando colorante violeta cristalino, el recuento viable en biopelículas y la visualización de biopelículas de Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter causa infecciones nosocomiales y su formación de biopelículas puede contribuir a la supervivencia en superficies secas como entornos hospitalarios. Por lo tanto, la cuantificación y visualización de biopelículas son métodos importantes para evaluar el potencial de las cepas de Acinetobacter para causar infecciones nosocomiales. Las biopelículas que se forman en la superficie de la microplaca se pueden cuantificar en términos de volumen y número de células. Los volúmenes de biopelícula se pueden cuantificar mediante tinción con violeta cristalino, lavado, decoloración con etanol y luego midiendo el colorante solubilizado con un lector de microplacas. Para cuantificar el número de células incrustadas en las biopelículas, las biopelículas se desechan utilizando raspadores celulares, se cosechan en la solución salina, se agitan vigorosamente en presencia de perlas de vidrio y se esparcen en agar Acinetobacter. A continuación, las placas se incuban a 30 °C durante 24-42 h. Después de la incubación, las colonias rojas se enumeran para estimar el número de células en las biopelículas. Este método de recuento viable también puede ser útil para contar células de Acinetobacter en biopelículas de especies mixtas. Las biopelículas de Acinetobacter se pueden visualizar utilizando tintes fluorescentes. Se emplea una microplaca disponible en el mercado diseñada para el análisis microscópico para formar biopelículas. A continuación, las biopelículas adheridas a la superficie inferior se tiñen con colorantes de yoduro de propidio y SYTO9, se lavan y luego se visualizan con microscopía de barrido láser confocal.
Introduction
Se sabe que Acinetobacter causa infecciones nosocomiales, y su infección en humanos, especialmente en centros de salud, se reporta cada vez más1. Está muy extendido en hospitales, centros de salud y entornos asociados a los alimentos 2,3,4. Puede sobrevivir durante un largo período en entornos que incluyen superficies hospitalarias como barandillas de camas, mesitas de noche, la superficie de ventiladores y lavabos4. Tal persistencia en las superficies ambientales puede ser uno de los factores significativos que contribuyen a las infecciones nosocomiales de Acinetobacter4.
El biofilm es una forma de vida microbiana y es una matriz microbiana compuesta por células microbianas vivas y sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de las células5. Las células microbianas están incrustadas en la matriz y, a menudo, son altamente resistentes a las tensiones ambientales como el calor, las sales, la sequedad, los antibióticos, los desinfectantes y las fuerzas de cizallamiento 6,7.
Acinetobacter puede formar biopelículas en las superficies, lo que sugiere que puede contribuir a una mayor supervivencia en las superficies ambientales, incluidas las superficies hospitalarias, y a una mayor resistencia al tratamiento con antibióticos 8,9. Además, la formación de biopelículas de Acinetobacter podría estar altamente asociada con los resultados clínicos humanos8. Por lo tanto, la formabilidad de la biopelícula de las cepas de Acinetobacter podría ser uno de los indicadores en la predicción de la supervivencia ambiental y de las infecciones humanas 8,10.
Las biopelículas adheridas a la superficie se pueden cuantificar y visualizar para evaluar la formabilidad de la biopelícula. Para cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, las biopelículas normalmente se tiñen con colorantes que tiñen la biopelícula, como el violeta cristalino, y los colorantes se eluyen en solución y se mide la densidad óptica11. La visualización de biopelículas es otro buen enfoque para evaluar la conformabilidad de las biopelículas11. El método de visualización de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) que emplea especificidad utilizando colorantes fluorescentes podría ser más útil para caracterizar la morfología de la biopelícula en comparación con otras técnicas como SEM12,13.
Las células viables en las biopelículas se pueden contar para estimar el número de células viables en las biopelículas11. Las células viables incrustadas en las biopelículas se desprenden, se diluyen, se esparcen en placas de agar, se incuban y se enumeran. Debido a que es probable que el mayor número de células cumpla con la dosis infecciosa, puede proporcionar información más detallada sobre las biopelículas, como los potenciales de infección asociados con el número de células13,14.
Este artículo presenta protocolos paso a paso para (1) cuantificar las biopelículas adheridas a la superficie, (2) contar las células viables en las biopelículas y (3) visualizar las biopelículas utilizando CLSM de Acinetobacter. Los protocolos presentados describen los métodos para evaluar la conformabilidad de las biopelículas de los aislados de Acinetobacter y caracterizar sus biopelículas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando el protocolo descrito, se midió y visualizó la formación de biopelículas de aislados de Acinetobacter en diversos grados y se estimaron las células viables en las biopelículas (Figura 1, Figura 2 y Figura 3).
En este protocolo, se utilizaron dos temperaturas diferentes, 30 °C para el crecimiento y 25 °C para la formación de biopelículas de Acinetobacter. Se utilizó …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa Principal de Investigación (E0210702-03) del Instituto de Investigación Alimentaria de Corea (KFRI), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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