Kvantifiering, viabilitetsbedömning och visualiseringsstrategier för biofilmer av acinetobacter
Summary
Detta protokoll beskriver beredningen av inokulatet, kvantifieringen av biofilm på mikrotiterplattor med hjälp av kristallviolett färgämne, det livskraftiga antalet i biofilmer och visualiseringen av biofilmer av Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter orsakar nosokomiala infektioner och dess biofilmbildning kan bidra till överlevnad på torra ytor som sjukhusmiljöer. Kvantifiering och visualisering av biofilm är därför viktiga metoder för att bedöma potentialen hos Acinetobacter-stammar att orsaka nosokomiala infektioner. De biofilmer som bildas på mikroplattans yta kan kvantifieras i termer av volym och cellantal. Biofilmvolymer kan kvantifieras genom färgning med kristallviolett, tvättning, avfärgning med etanol och sedan mätning av det lösliga färgämnet med hjälp av en mikroplattläsare. För att kvantifiera antalet celler som är inbäddade i biofilmerna skrapas biofilmerna bort med hjälp av cellskrapor, skördas i saltlösningen, omrörs kraftigt i närvaro av glaspärlor och sprids på Acinetobacter-agar. Därefter inkuberas plattorna vid 30 °C i 24-42 timmar. Efter inkubationen räknas de röda kolonierna upp för att uppskatta antalet celler i biofilmerna. Denna livskraftiga räkningsmetod kan också vara användbar för att räkna Acinetobacter-celler i biofilmer av blandade arter. Biofilmer från Acinetobacter kan visualiseras med hjälp av fluorescerande färgämnen. En kommersiellt tillgänglig mikroplatta avsedd för mikroskopisk analys används för att bilda biofilmer. Därefter färgas de biofilmer som fästs på bottenytan med SYTO9 och propidiumjodidfärgämnen, tvättas och visualiseras sedan med konfokal laserskanningsmikroskopi.
Introduction
Acinetobacter är känt för att orsaka nosokomiala infektioner, och dess infektion hos människor, särskilt på vårdinrättningar, rapporteras alltoftare 1. Det är utbrett på sjukhus, vårdinrättningar och livsmedelsrelaterade miljöer 2,3,4. Det kan överleva under lång tid i miljöer inklusive sjukhusytor som sängräcken, nattduksbord, ytan på ventilatorer och handfat4. Sådan persistens på ytor i omgivningen kan vara en av de signifikanta faktorer som bidrar till de nosokomiala infektionerna av Acinetobacter4.
Biofilm är en form av mikrobiellt liv och är en mikrobiell matris som består av levande mikrobiella celler och extracellulära polymera ämnen (EPS) från cellerna5. De mikrobiella cellerna är inbäddade i matrisen och är ofta mycket motståndskraftiga mot miljöpåfrestningar som värme, salter, torrhet, antibiotika, desinfektionsmedel och skjuvkrafter 6,7.
Acinetobacter kan bilda biofilmer på ytor, vilket tyder på att det kan bidra till förlängd överlevnad på miljöytor, inklusive sjukhusytor, och ökad resistens mot antibiotikabehandling 8,9. Dessutom kan biofilmbildningen av Acinetobacter vara starkt associerad med kliniska resultat hos människa8. Därför kan biofilmformbarheten hos Acinetobacter-stammar vara en av indikatorerna för att förutsäga miljööverlevnad och infektioner hos människor 8,10.
De ytfästa biofilmerna kan kvantifieras och visualiseras för att bedöma biofilmens formbarhet. För att kvantifiera ytfästa biofilmer färgas biofilmerna normalt av biofilmfärgande färgämnen som kristallviolett, och färgämnena elueras i lösning och mäts för optisk densitet11. Visualisering av biofilmer är en annan bra metod för att bedöma biofilmens formbarhet11. Visualiseringsmetod med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) som använder specificitet med fluorescerande färgämnen kan vara mer användbar för att karakterisera biofilmens morfologi jämfört med andra tekniker såsom SEM12,13.
De livskraftiga cellerna i biofilmer kan räknas för att uppskatta antalet livskraftiga celler i biofilmer11. De livsdugliga cellerna som är inbäddade i biofilmer lösgörs, späds ut, sprids på agarplattor, inkuberas och räknas. Eftersom det högre antalet celler sannolikt uppfyller den infektiösa dosen kan det ge mer detaljerad information om biofilmer, såsom infektionspotentialer associerade med antalet celler13,14.
Denna artikel presenterar steg-för-steg-protokoll för att (1) kvantifiera ytfästa biofilmer, (2) räkna livskraftiga celler i biofilmerna och (3) visualisera biofilmerna med hjälp av CLSM av Acinetobacter. De presenterade protokollen beskriver metoderna för att bedöma biofilmens formbarhet hos Acinetobacter-isolat och karakterisera deras biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av det beskrivna protokollet mättes, visualiserades biofilmbildningen av Acinetobacter-isolat med varierande grad och de livskraftiga cellerna i biofilmerna uppskattades (Figur 1, Figur 2 och Figur 3).
I detta protokoll användes två olika temperaturer, 30 °C för tillväxt och 25 °C för biofilmbildning av Acinetobacter. 30 °C användes eftersom många studier använde m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av huvudforskningsprogrammet (E0210702-03) vid Korea Food Research Institute (KFRI), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
