Tvåfotonkalciumavbildning av framhjärnans aktivitet hos vuxna zebrafiskar som beter sig
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.
Abstract
Vuxna zebrafiskar (Danio rerio) uppvisar en rik repertoar av beteenden för att studera kognitiva funktioner. De har också en miniatyrhjärna som kan användas för att mäta aktiviteter i olika hjärnregioner genom optiska avbildningsmetoder. Rapporter om registrering av hjärnaktivitet hos vuxna zebrafiskar har dock varit knapphändiga. Den aktuella studien beskriver procedurer för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar. Vi fokuserar på åtgärder för att hindra vuxna zebrafiskar från att röra på huvudet, vilket ger stabilitet som möjliggör laserskanning av hjärnaktiviteten. De fastspända djuren kan röra sina kroppsdelar fritt och andas utan hjälpmedel. Proceduren syftar till att förkorta tiden för huvudstödsoperation, minimera hjärnans rörelser och maximera antalet neuroner som registreras. Här beskrivs också ett upplägg för att presentera en uppslukande visuell miljö under kalciumavbildning, som kan användas för att studera neurala korrelat som ligger till grund för visuellt utlösta beteenden.
Introduction
Kalciumfluorescensavbildning med genetiskt kodade indikatorer eller syntetiska färgämnen har varit en kraftfull metod för att mäta neuronal aktivitet hos djur som beter sig, inklusive icke-mänskliga primater, gnagare, fåglar och insekter1. Aktiviteten hos hundratals celler, upp till cirka 800 μm under hjärnans yta, kan mätas samtidigt med hjälp av multifotonavbildning 2,3. Aktiviteten hos specifika celltyper kan också mätas genom att uttrycka kalciumindikatorer i genetiskt definierade neuronala populationer. Tillämpning av avbildningsmetoden för modeller av små ryggradsdjur öppnar nya möjligheter inom neuronala beräkningar över hjärnregioner.
Zebrafiskar är ett mycket använt modellsystem inom neurovetenskaplig forskning. Zebrafisklarver cirka 6 dagar efter befruktning har använts för kalciumavbildning på grund av deras miniatyrhjärna och genomskinliga kropp4. Juvenila zebrafiskar (3-4 veckor gamla) används också för att studera de neurala mekanismer som ligger till grund för sensomotoriska banor 5,6. Den maximala prestationsnivån för komplexa beteenden, inklusive associativ inlärning och sociala beteenden, uppnås dock vid en högre ålderpå 7,8 år. Därför krävs ett tillförlitligt protokoll för att studera flera kognitiva funktioner i hjärnan hos vuxna zebrafiskar med hjälp av avbildningsmetoder. Medan zebrafisklarver och unga zebrafiskar kan bäddas in i agaros för in vivo-avbildning, lider vuxna zebrafiskar vid 2 månader eller äldre av hypoxi under sådana förhållanden och är fysiskt för starka för att hållas tillbaka av agaros. Därför krävs ett kirurgiskt ingrepp för att stabilisera hjärnan och göra det möjligt för djuret att andas fritt genom gälarna.
Här beskriver vi ett nackstödsprotokoll som innebär en ny design av en enda huvudbåge. Den förkortade operationstiden på 25 minuter är dubbelt så snabb som den tidigare metoden9. Vi beskriver också utformningen av inspelningskammaren (semi-sexkantig tank), huvudsteget och en snabblåsmekanism för att kombinera de två delarna9. Slutligen beskrivs också upplägget för att presentera en uppslukande visuell stimulans för att studera visuellt utlöst hjärnaktivitet och beteenden. Sammantaget kan de procedurer som beskrivs här användas för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i genetiskt definierade cellpopulationer i en vuxen zebrafisk med fastspända huvud, vilket möjliggör undersökning av hjärnaktiviteter under olika beteendeparadigm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att hålla fast huvudet på vuxna zebrafiskar för kalciumavbildning med två fotoner. Det finns två viktiga steg för att uppnå ett nackstöd som är tillräckligt stabilt för laserskanning. Först måste huvudstången limmas fast på skallarnas specifika fästställen. Andra delar av skallen är ofta för tunna för att ge mekanisk stabilitet och kan till och med få frakturer vid starka kroppsrörelser. För det andra måste huden ovanför fästställena tas bort nogg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica och National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstaden vid Institute of Physics, Academia Sinica hjälpte till att tillverka specialdesignade delar. Vi vill också tacka P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) för utformningen av huvudstegets snabblåsmekanism.
Materials
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen – GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
