I denne protokollen diskuterer vi implementeringen av en modell for vellykket ortotopisk levertransplantasjon (OLT) hos mus. I tillegg diskuteres adjuvanser for å analysere allograftpatency etter vellykket OLT i en mus også, spesielt ved bruk av mikrocomputertomografi (microCT) skanner.
Microcomputed tomography (microCT) angiografi er en uvurderlig ressurs for forskere. Nye fremskritt i denne teknologien har gjort det mulig å få bilder av høy kvalitet av mikrovaskulatur og er hi-fidelity-verktøy innen organtransplantasjon. I denne modellen av ortotopisk levertransplantasjon (OLT) hos mus, gir microCT muligheten til å evaluere allograft anastomose i sanntid og har den ekstra fordelen av ikke å måtte ofre studiedyr. Valget av kontrast, samt innstillinger for bildeoppkjøp, skaper et HD-bilde, noe som gir forskere uvurderlig informasjon. Dette muliggjør evaluering av de tekniske aspektene ved prosedyren, samt potensielt evaluering av ulike terapier over lengre tid. I denne protokollen beskriver vi en OLT-modell hos mus på en trinnvis måte og beskriver til slutt en microCT-protokoll som kan gi bilder av høy kvalitet, noe som hjelper forskere i grundig analyse av solid organtransplantasjon. Vi gir en trinnvis veiledning for levertransplantasjon hos mus, samt diskuterer kort en protokoll for evaluering av podens av transplantatet gjennom microCT-angiografi.
Transplantasjon er den eneste effektive behandlingen for leversykdom i sluttstadiet. Nytten av levertransplantasjon er unektelig utmerket, med en median overlevelse på 11,6 år versus 3,1 år på venteliste1. Imidlertid er det betydelige begrensninger som begrenser den brede anvendelsen av levertransplantasjon, og inkluderer viktigst av alt, mangel på egnede donororganer av høy kvalitet. Utvidelse av donororganpoolen vil derfor kreve innovative strategier som gjør det mulig å bruke allotransplantater som i dag anses som uegnede, noe som øker sikkerhetsmarginen for transplantasjon. Derfor, for å forbedre tilgangen til levertransplantasjon, er det viktig å gjennomføre prekliniske studier hos små dyr.
Spesielt viktig for transplantasjonsforskningen er in vivo-modeller for transplantasjon. Ortotopisk levertransplantasjon fra mus (OLT) har eksistert i nesten 30 år2 og er avgjørende for å studere mange aspekter ved transplantasjon, inkludert karakterisering av immunresponser, iskemi-reperfusjonsskade, akutt avvisning, terapeutiske effekter av nye midler og langsiktig overlevelse 3,4,5,6,7. Bruken av mus for å studere transplantasjon er viktig, da det muliggjør bruk av transgene muselinjer for å studere virkningen av spesifikke molekylære veier på utfallet av transplantasjon. Etablerte protokoller for levertransplantasjon fra mus har blitt godt beskrevet tidligere 8,9.
Flere metoder for anastomoser finnes for supra og infra hepatisk inferior vena cava (IVC), portalvene (PV) og vanlig gallegang (CBD). De er vanligvis avhengige av enten håndanastomose eller en modifisert vaskulær mansjettteknikk som ligner på murine lungetransplantasjon 10,11,12. Et viktig skritt i den langsiktige studien og overlevelsen til mottakermusene, samt utviklingen av et vedvarende levertransplantasjonsprogram for mus, er evnen til å evaluere disse kritiske anastomosene. Imaging modaliteter for å evaluere leverallograft patency er ofte avhengig av ultralyd og datatomografi (CT) i klinisk setting13,14. CT har en klar fordel i forhold til ultralyd, da det kan gi utsikt over hele magen for å inkludere enhver anastomose, selv om det kan være spesielt vanskelig å oppnå disse synspunktene med ultralyd hos små dyr. Betydelig forskning og ressurser har blitt viet til å utvikle nøyaktig microCT med det formål å forbedre dyreforsøk og informasjonen vi kan samle fra disse modellene av skade og sykdom15,16. Her beskriver vi en protokoll for ortotopisk levertransplantasjon fra mus (figur 1) og beskriver kort en protokoll for microCT for å evaluere allograftpatency og persistabilitet av anastomoser.
OLT hos gnagere er godt beskrevet i litteraturen 2,8. For å utføre denne teknisk krevende prosedyren, er det ofte nødvendig med flere år med mikrokirurgi (eller kirurgi generelt), da dette innebærer en robust forståelse av anatomi og teknisk evne. I utviklingen av denne modellen møtte vi flere tekniske problemer som alle dreide seg om anastomosene. Spesielt ved PV-anastomosen er det ofte vanskelig å stabilisere venen for anastomose. Vi har funnet ut at plassering av en eller to suturer (kirurgpreferanse) hjelper med å lette mansjettplasseringer. Det skal bemerkes at plassering av flere oppholdssuturer øker kirurgisk tid.
I tillegg er SHIVC dypt inne i bukhulen og er vanskelig å plassere en klemme på for å gi tilstrekkelig eksponering. Vi har funnet ut at hvis musen er avslappet som mulig i sin tilbakeholdenhet, vil det legge til fleksibiliteten i venen. Til syvende og sist vil det være opp til kirurgen å bestemme riktig plassering med praksis. Videre, med CBD-anastomose, er kanalen igjen veldig delikat. Det kan være vanskelig å plassere oppholdssuturer for å stabilisere kanalen, og muligens vil plassering på et lite stykke gasbind hjelpe til med stabiliseringen. Til slutt, da alle små pattedyr er unikt delikate med hensyn til anestesitid, er det viktig å utføre operasjonen så raskt som mulig. Ideelle kirurgiske tider er som følger: 1) donoroperasjon, 45-60 min; 2) forberedelse av bakbordet, 15 min; 3) Mottakerdrift, 60-80 min. Øvelse vil bidra til å redusere bortkastet bevegelse.
Etter hvert som dyremodeller utvikler seg, har evnen til å evaluere suksessen til studieintervensjoner også avansert. MicroCT ble først brukt til å gjennomføre studier på vaskulatur hos rotter på slutten av 1990-tallet17. Det er mange utfordringer med å utføre nøyaktige og klare mikroCT angiografistudier hos gnagere. Imidlertid stammer de fleste utfordringene fra de korte hjerte- og respiratoriske syklusene til disse pattedyrene. Dette overvinnes ved å bruke korte eksponeringer for å begrense bevegelsesartefakter samt høyere fotonfluenshastigheter18. Generelt fant vi at bruk av hjertegating, samt justering av isofluran for å redusere respirasjonsfrekvensen, ga de klareste bildene. Vi har også funnet at bruk av gnagerspesifikk kontrasttiming for spesifikke faser: leverarteriefase, portalvenøs fase og forsinket fase også har forbedret visualisering19. Bruken av ExiTron nano 12000 kontrast har flere fordeler og kan forbedre den generelle bildekvaliteten. Det gir den sterkeste kontrastforsterkningen i leveren20 og blodet21. En annen fordel er at kontrasten er tilstede i leveren i opptil 120 timer etter den første injeksjonen, noe som kan redusere den tilknyttede levertoksisiteten, da mindre kontrast er nødvendig hvis gjentatte skanningerer nødvendige.
Videre, fordi skanninger utføres med musen bedøvet med isofluran endres ikke kontrastforsterkningen med denne endringen i fysiologi20. Ved å bruke disse avbildningsteknikkene og ExiTron-kontrasten, er en klar evaluering av vellykkede anastomoser i OLT mulig. MicroCT muliggjør ikke-invasiv evaluering av in vivo allotransplantater over en lengre periode. Denne protokollen reduserer antall dyr som må ofres for å evaluere vaskulære anastomoser og gir muligheten til å studere terapeutika over flere uker og deres effekt på vaskulaturen.
Begrensninger
Det skal bemerkes at mens flere revisjoner av OLT-modellen har skjedd for å perfeksjonere teknikken, er visualiseringen av anastomosene ved hjelp av microCT fortsatt en pågående prosess. Videre tilbyr mus OLT et unikt innblikk i transplantasjonsmedisin. Det er imidlertid ikke en omfattende modell, da det er vanskelig å holde disse musene i live etter 1 uke. Ytterligere transplantasjonsmodeller bør også brukes for ytterligere å underbygge prekliniske eksperimenter.
Konklusjoner
Fremskritt innen microCT har raskt utviklet seg det siste tiåret, og gir forskere uvurderlige nye verktøy innen dyremodeller og transplantasjon. I fremtiden vil mer detaljert 3D-avbildning gi ytterligere innsikt i forskning og oppdagelse.
The authors have nothing to disclose.
SMB støttes av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) tilskudd R01DK1234750. BAW støttes gjennom National Institutes of Health National Heart Lung and Blood Institute grant R01HL143000.
#11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |