I detta protokoll diskuterar vi implementeringen av en modell för framgångsrik ortotopisk levertransplantation (OLT) i möss. Dessutom diskuteras adjuvans för att ytterligare analysera allograftpatency efter framgångsrik OLT i en mus, särskilt med hjälp av mikrodatortomografi (microCT) skanningar.
Mikrodatortomografi (microCT) angiografi är en ovärderlig resurs för forskare. Nya framsteg inom denna teknik har gjort det möjligt att få högkvalitativa bilder av mikrovaskulatur och är högupplösta verktyg inom området organtransplantation. I denna modell av ortotopisk levertransplantation (OLT) på möss ger mikroCT möjlighet att utvärdera allograftanastomos i realtid och har den extra fördelen att man inte behöver offra försöksdjur. Valet av kontrast, liksom inställningarna för bildtagning, skapar en högupplöst bild, vilket ger forskarna ovärderlig information. Detta gör det möjligt att utvärdera de tekniska aspekterna av proceduren samt potentiellt utvärdera olika terapier under en längre tidsperiod. I detta protokoll beskriver vi stegvis en OLT-modell i möss och beskriver slutligen ett mikroCT-protokoll som kan ge bilder av hög kvalitet, vilket hjälper forskare att djupanalysera transplantation av solida organ. Vi ger en steg-för-steg-guide för levertransplantation i en mus, samt diskuterar kortfattat ett protokoll för att utvärdera transplantatets patens genom mikroCT-angiografi.
Transplantation är den enda effektiva behandlingen för leversjukdom i slutstadiet. Nyttan av levertransplantation är onekligen utmärkt, med en medianöverlevnad på 11,6 år jämfört med 3,1 år på väntelistan1. Det finns dock betydande begränsningar som begränsar en bred tillämpning av levertransplantation, och viktigast av allt, bristen på lämpliga donatororgan av hög kvalitet. En utvidgning av donatororganpoolen kommer därför att kräva innovativa strategier som möjliggör användning av transplantat som för närvarande anses olämpliga i dag, vilket ökar säkerhetsmarginalen för transplantation. För att förbättra tillgången till levertransplantation är det därför absolut nödvändigt att genomföra prekliniska studier på smådjur.
Särskilt viktiga för transplantationsforskningen är in vivo-modeller av transplantation. Ortotopisk levertransplantation (OLT) har funnits i nästan 30 år2 och är avgörande för att studera många aspekter av transplantation, inklusive karakterisering av immunsvar, ischemi-reperfusionsskada, akut avstötning, terapeutiska effekter av nya läkemedel och långtidsöverlevnad 3,4,5,6,7. Användningen av möss för att studera transplantation är avgörande eftersom det möjliggör användning av transgena muslinjer för att studera effekten av specifika molekylära vägar på resultaten av transplantation. Etablerade protokoll för levertransplantation hos möss har beskrivits väl tidigare 8,9.
Det finns flera metoder för anastomoser för supra- och infralevern inferior vena cava (IVC), portvenen (PV) och den gemensamma gallgången (CBD). De förlitar sig vanligtvis på antingen handanastomos eller en modifierad vaskulär manschettteknik som liknar murin lungtransplantation 10,11,12. Ett viktigt steg i den långsiktiga studien och överlevnaden av mottagarmössen, samt utvecklingen av ett hållbart levertransplantationsprogram för möss, är möjligheten att utvärdera dessa kritiska anastomoser. Bildmetoder för att utvärdera leverallograftpatency förlitar sig ofta på ultraljud och datortomografi (CT) i den kliniska miljön13,14. CT har en klar fördel jämfört med ultraljud eftersom det kan erbjuda bilder av hela buken för att inkludera varje anastomos, även om det kan vara särskilt svårt att få dessa bilder med ultraljud hos små djur. Betydande forskning och resurser har ägnats åt att utveckla korrekt mikroCT i syfte att förbättra djurstudier och den information vi kan samla in från dessa modeller av skador och sjukdomar 15,16. Här beskriver vi ett protokoll för ortotopisk muslevertransplantation (Figur 1) och beskriver kortfattat ett protokoll för mikroCT för att utvärdera allograftpatency och varaktighet av anastomoser.
OLT hos gnagare har beskrivits väl i litteraturen 2,8. För att utföra detta tekniskt krävande ingrepp krävs ofta flera års mikrokirurgi (eller kirurgi i allmänhet) eftersom detta kräver en gedigen förståelse för anatomi och teknisk förmåga. När vi utvecklade den här modellen stötte vi på flera tekniska problem som alla kretsade kring anastomoserna. Särskilt med PV-anastomos är det ofta svårt att stabilisera venen för anastomos. Vi har funnit att placering av en eller två suturer (kirurgpreferens) hjälper till att underlätta manschettplaceringar. Det bör noteras att placering av fler stygn ökar operationstiden.
Dessutom är SHIVC djupt inne i bukhålan och är svår att placera en klämma på för att ge tillräcklig exponering. Vi har funnit att om musen är så avslappnad som möjligt i sin fasthållning, kommer det att öka venens flexibilitet. I slutändan är det upp till kirurgen att bestämma rätt placering med praktiken. Dessutom, med CBD-anastomos, är kanalen återigen mycket känslig. Det kan vara svårt att placera stagsuturer för att stabilisera kanalen, och möjligen kan det hjälpa till att stabilisera den genom att placera den på en liten bit gasbinda. Slutligen, eftersom alla små däggdjur är unikt känsliga när det gäller anestesitid, är det viktigt att utföra operationen så snabbt som möjligt. Idealiska operationstider är följande: 1) donatoroperation, 45-60 min; 2) förberedelse av bakbordet, 15 min; 3) Mottagaroperation, 60-80 min. Övning hjälper till att minska slöseri med rörelse.
I takt med att djurmodeller utvecklas har också förmågan att utvärdera framgången med studieinterventioner utvecklats. MicroCT användes först för att genomföra studier på kärl hos råttor i slutet av 1990-talet17. Det finns många utmaningar med att utföra noggranna och tydliga mikroCT-angiografistudier på gnagare. De flesta av utmaningarna uppstår dock på grund av dessa däggdjurs korta hjärt- och andningscykler. Detta övervinns genom att använda korta exponeringar för att begränsa rörelseartefakter samt högre fotonfluenshastigheter18. Generellt fann vi att användningen av hjärtgrinding, liksom justeringen av isoflurankoncentrationerna för att minska andningsfrekvensen, gav de tydligaste bilderna. Vi har också funnit att användning av gnagarspecifik kontrasttiming för specifika faser: leverartärfas, portalvenös fas och fördröjd fas också har förbättrat visualisering19. Användningen av ExiTron nano 12000 kontrast har flera fördelar och kan förbättra den övergripande bildkvaliteten. Det ger den starkaste kontrastförbättringen i levern20 och blodet21. En annan fördel är att kontrasten finns i levern i upp till 120 timmar efter den första injektionen, vilket kan minska associerad levertoxicitet eftersom mindre kontrast behövs om upprepade skanningar krävs20.
Dessutom, eftersom skanningar utförs med musen sederad med isofluran, förändras inte kontrastförbättringen med denna förändring i fysiologi20. Genom att använda dessa avbildningstekniker och ExiTron-kontrast är en tydlig utvärdering av framgångsrika anastomoser i OLT möjlig. MicroCT möjliggör icke-invasiv utvärdering av in vivo-transplantat under en längre period. Detta protokoll minskar antalet djur som måste offras för att utvärdera vaskulära anastomoser och ger möjlighet att studera terapier under flera veckor och deras effekt på kärlen.
Begränsningar
Det bör noteras att även om flera revideringar av OLT-modellen har skett för att fullända dess teknik, är visualiseringen av anastomoserna med hjälp av mikroCT fortfarande en pågående process. Dessutom ger mus OLT en unik inblick i transplantationsmedicin. Det är dock inte en heltäckande modell då det är svårt att hålla dessa möss vid liv efter 1 vecka. Ytterligare transplantationsmodeller bör också användas för att ytterligare underbygga prekliniska experiment.
Slutsatser
Framstegen inom mikroCT har gått snabbt framåt under det senaste decenniet, vilket ger forskare ovärderliga nya verktyg inom området djurmodeller och transplantation. I framtiden kommer mer detaljerad 3D-avbildning att ge ytterligare insikter i forskning och upptäckter.
The authors have nothing to disclose.
SMB stöds av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) anslag R01DK1234750. BAW stöds genom National Institutes of Healths National Heart Lung and Blood Institute-anslag R01HL143000.
#11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
Dumont Medical #5/45 Forceps – Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |