सीमित पाचन के साथ युग्मित संवर्धन मोती का उपयोग करके मेजबान सेल प्रोटीन विश्लेषण
Summary
दवा उत्पादों (डीपी) से मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को समृद्ध करने और प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करके पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। विधि को इन-हाउस निर्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) दवा पदार्थ (डीएस) का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, जो प्रदर्शन के संदर्भ में विभिन्न तरीकों के मूल्यांकन और तुलना के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता संदर्भ सामग्री है।
Abstract
मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो चिकित्सीय प्रोटीन पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकती हैं, यहां तक कि कम मात्रा में भी। दवा उत्पादों से जुड़े संभावित जोखिमों का मूल्यांकन करने के लिए, कम बहुतायत वाले एचसीपी की पहचान करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। एक संवेदनशील एचसीपी डिटेक्शन विधि विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण में एचसीपी को समृद्ध करना शामिल है, साथ ही विश्लेषण से पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) को हटाना, तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) का उपयोग करना।
इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोती का उपयोग मेजबान सेल प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है. इन मोतियों में विभिन्न प्रोटीनों के लिए विशिष्ट समानता के साथ हेक्सापेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। प्रोटोकॉल में नैनो एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके सीमित पाचन और बाद में पेप्टाइड का पता लगाना भी शामिल है। इन तकनीकों को नियोजित करके, कम बहुतायत वाले एचसीपी को 7000 गुना से अधिक समृद्ध किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 0.002 पीपीएम जितनी कम प्रभावशाली पहचान सीमा होती है। गौरतलब है कि यह प्रोटोकॉल एनआईएसटी एमएबी का उपयोग करके उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ 850 एचसीपी का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसे उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाया गया है और इसके कार्यान्वयन में सहायता के लिए एक वीडियो प्रदर्शन शामिल है। इन चरणों का पालन करके, शोधकर्ता एचसीपी को प्रभावी ढंग से समृद्ध और पहचान सकते हैं, जिससे दवा उत्पादों के लिए जोखिम मूल्यांकन की संवेदनशीलता और सटीकता बढ़ जाती है।
Introduction
मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो मेजबान जीव की सेल संस्कृति से जारी होती हैं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी)1,2,3,4के साथ सह-शुद्ध होती हैं। एचसीपी का ट्रेस स्तर दवा उत्पाद 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, उप-पीपीएम से पीपीएम स्तरों में एचसीपी का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील एचसीपी विश्लेषण विधि वांछित है।
कम बहुतायत में एचसीपी का पता लगाने के लिए ऑर्थोगोनल विधियों को लागू किया जा सकता है। एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) आम तौर पर समग्र एचसीपी मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह भी इसी एंटीबॉडी16 उपलब्ध हैं, तो यह भी पता लगाने और व्यक्तिगत एचसीपी मात्रा निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि, एचसीपी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन समय लेने वाली और श्रम-गहन है। इसके विपरीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमैटोग्राफी एमएबी दवा उत्पादों में व्यक्तिगत एचसीपी के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकती है और एचसीपी पहचान के लिए व्यापक रूप से लागू होती है 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
एमएस के साथ एचसीपी का पता लगाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें सीमित पाचन20, निस्पंदन17, प्रोटीन ए विलोपन21, इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी), और प्रोटीन माइनर संवर्धन (पीएम)18शामिल हैं। अधिकांश विधियों का उद्देश्य एमएबी की मात्रा को कम करना और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण से पहले एचसीपी को समृद्ध करना है, जिससे एमएबी पेप्टाइड्स और एचसीपी पेप्टाइड्स के बीच गतिशील रेंज कम हो जाती है। यह प्रोटोकॉल एक प्रोटिओमिक नमूना संवर्धन विधि प्रस्तुत करता है जो प्रोटिओमाइनर प्रौद्योगिकी और सीमित पाचन (पीएमएलडी)28को जोड़ती है। ProteoMiner संवर्धन सिद्धांत में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करना शामिल है जिसमें कॉम्बिनेटरियल पेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। ये लिगैंड विशेष रूप से एंटीबॉडी-ड्रग उत्पादों पर प्रोटीन से बंधते हैं, जिससे अतिरिक्त अणुओं को हटाने की अनुमति मिलती है, जबकि उनके संबंधित आत्मीयता लिगैंड पर कम-बहुतायत वाले मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को केंद्रित किया जाता है। दूसरी ओर, सीमित पाचन के सिद्धांत में ट्रिप्सिन की कम सांद्रता का उपयोग करना शामिल है। यह एकाग्रता कम मात्रा वाले एचसीपी को पचाने के लिए पर्याप्त है लेकिन सभी एंटीबॉडी दवा उत्पादों को पचाने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह दृष्टिकोण समाधान से पचाने वाले एचसीपी पेप्टाइड्स की वसूली और संवर्धन को सक्षम बनाता है।
निस्पंदन विधियों की तुलना में, पीएमएलडी तकनीक का पता लगाया एचसीपी17 के आकार से सीमित नहीं है. प्रोटीन एक विलोपन विधियां एंटीबॉडी21 से जुड़े एचसीपी का पता लगाने के लिए विशिष्ट हैं, जबकि इम्यूनोप्रिपिटेशन एक विशेष सेल लाइन (जैसे चीनी हम्सटर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन) से पूर्वनिर्धारित एचसीपी तक सीमित है, जहां एक एंटी-एचसीपी एंटीबॉडीउत्पन्न हुई थी 4. इसके विपरीत, पीएमएलडी को किसी भी दवा मॉड्यूल से एचसीपी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न सेल लाइनों से दवा उत्पादों के साथ सह-शुद्ध सेल प्रोटीन होस्ट किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पीएमएलडी उल्लिखित विधियों 17,18,20,21,24 की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है।
यह दृष्टिकोण एचसीपी एकाग्रता को 7000 गुना तक समृद्ध कर सकता है और पता लगाने की सीमा को 0.002 पीपीएम28 तक कम कर सकता है। प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में सचित्र है.
Protocol
Representative Results
Discussion
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन संवर्धन मोतियों के दो संस्करण हैं: एक छोटी क्षमता के साथ और दूसरा बड़ी क्षमता के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें)। संवर्धन मोतियों के दोनों संस्करणों में पैकेज में ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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