エンリッチメントビーズと限定消化を組み合わせた宿主細胞タンパク質分析(英語)
Summary
医薬品(DP)から宿主細胞タンパク質(HCP)を濃縮し、プロテオーム濃縮ビーズを使用してペプチドを検出するためのプロトコルが示されています。この分析法は、自社製のモノクローナル抗体(mAb)原薬(DS)を使用して実証されており、これは、性能の観点からさまざまな分析法を評価および比較するための十分に特性評価された標準物質です。
Abstract
宿主細胞タンパク質(HCP)は、少量であっても治療用タンパク質に悪影響を与える可能性のある不純物です。医薬品に関連する潜在的なリスクを評価するために、存在量の少ない医療従事者を特定する方法が開発されています。高感度の HCP 検出法を開発するための重要なアプローチは、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を利用して、分析前にモノクローナル抗体(mAb)を除去すると同時に HCP を濃縮することです。
このプロトコルは市販のプロテオーム濃縮のビードを使用して宿主のセル蛋白質を富ませるための詳しい指示を提供する。これらのビーズには、さまざまなタンパク質に特異的な親和性を持つヘキサペプチドリガンドの多様なライブラリが含まれています。このプロトコルには、ナノLC-MS/MSを使用した限定的な消化とその後のペプチド検出も組み込まれています。これらの技術を採用することで、存在量の少ない HCP を 7,000 倍以上濃縮することができ、検出限界は 0.002 ppm という驚異的な数値になります。重要なことに、このプロトコルでは、NIST mAb を使用して 850 の HCP を高い信頼性で検出できます。さらに、ユーザーフレンドリーになるように設計されており、その実装を支援するためのビデオデモンストレーションが含まれています。これらのステップを踏むことで、研究者は医療従事者を効果的に濃縮して検出し、医薬品のリスク評価の感度と精度を高めることができます。
Introduction
宿主細胞タンパク質(HCP)は、宿主生物の細胞培養から放出され、モノクローナル抗体(mAb)と共精製される不純物です1,2,3,4。微量レベルのHCPは、医薬品の品質に悪影響を与える可能性があります5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、したがって、サブppmからppmレベルのHCPを検出するには、高感度のHCP分析法が望まれています。
直交的な方法を適用して、少量のHCPを検出できます。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、一般的にHCP全体の定量に使用され、対応する抗体が利用可能であれば、個々のHCPを検出して定量することもできます16。しかし、HCP特異的抗体の産生には時間と労力がかかります。対照的に、質量分析(LC-MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーは、モノクローナル抗体医薬品中の個々のHCPに関する包括的な情報を提供することができ、HCPの同定に広く適用されています4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21、22、23、24、25、26、27。
LC-MS/MS で HCP を検出するために、限定消化20、ろ過17、プロテイン A 欠失21、免疫沈降 (IP)、ProteoMiner 濃縮 (PM)18 など、いくつかの方法が開発されています。ほとんどの分析法は、LC-MS/MS 分析の前にモノクローナル抗体の量を減らし、HCP を濃縮することで、モノクローナル抗体ペプチドと HCP ペプチドの間のダイナミックレンジを狭めることを目的としています。このプロトコルは、ProteoMiner技術と限られた消化(PMLD)を組み合わせたプロテオミクスサンプル濃縮法を提示します28。ProteoMiner エンリッチメントの原理では、コンビナトリアルペプチドリガンドの多様なライブラリーを含む市販のプロテオームエンリッチメントビーズを使用します。これらのリガンドは、抗体医薬品上のタンパク質に特異的に結合し、過剰な分子を除去しながら、少量の宿主細胞タンパク質(HCP)をそれぞれのアフィニティーリガンドに濃縮します。一方、限られた消化の原則には、低濃度のトリプシンを使用することが含まれます。この濃度は、少量のHCPを消化するには十分ですが、すべての抗体医薬品を消化するには十分ではありません。このアプローチにより、溶液から消化されたHCPペプチドを回収し、濃縮することができます。
濾過法と比較して、PMLD技術は、検出されたHCPのサイズによって制限されない17。プロテインA欠失法は、抗体に結合したHCPの検出に特異的であるが21、免疫沈降は、抗HCP抗体が産生された特定の細胞株(チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株など)由来の事前定義されたHCPに限定される4。対照的に、PMLDは、さまざまな細胞株の医薬品と共精製された任意の薬物モジュールおよび宿主細胞タンパク質からのHCPを検出するために適用できます。さらに、PMLDは、前述の方法17、18、20、21、24と比較して、より優れた感度を示します。
このアプローチにより、HCP 濃度を 7000 倍に濃縮し、検出限界を 0.002 ppm28 に下げることができます。実験装置を 図1に示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
市販のタンパク質濃縮ビーズには、容量の小さいものと容量の大きいものの2種類があります( 材料表を参照)。どちらのバージョンの濃縮ビーズにも、パッケージに 10 個のプレップが含まれています。メーカーの説明書では、小容量キットの各調製物を使用して、10 mgの総タンパク質を濃縮できることが示唆されています。ただし、DS からの宿主細胞タンパク質(HCP)濃縮の最適な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
References
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
