Ett protokoll presenteras för att berika värdcellsproteiner (HCP) från läkemedelsprodukter (DP) och detektera peptider med hjälp av proteomanrikningspärlor. Metoden demonstreras med hjälp av en egentillverkad monoklonal antikropp (mAb) läkemedelssubstans (DS), som är ett välkarakteriserat referensmaterial för att utvärdera och jämföra olika metoder med avseende på prestanda.
Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som kan påverka terapeutiska proteiner negativt, även i små mängder. För att utvärdera de potentiella riskerna i samband med läkemedelsprodukter har metoder utvecklats för att identifiera hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst. Ett viktigt tillvägagångssätt för att utveckla en känslig HCP-detektionsmetod är att berika HCP:er och samtidigt avlägsna monoklonala antikroppar (mAbs) före analys, med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS).
Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för anrikning av värdcellsproteiner med hjälp av kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor. Dessa pärlor innehåller ett varierat bibliotek av hexapeptidligander med specifika affiniteter för olika proteiner. Protokollet innehåller också begränsad matsmältning och efterföljande peptiddetektion med hjälp av nano LC-MS/MS. Genom att använda dessa tekniker kan HCP:er med låg förekomst anrikas över 7000 gånger, vilket resulterar i en imponerande detektionsgräns så låg som 0,002 ppm. Betecknande nog möjliggör detta protokoll detektering av 850 hälso- och sjukvårdspersonal med en hög konfidensnivå med hjälp av en NIST-mAb. Dessutom är den utformad för att vara användarvänlig och innehåller en videodemonstration för att hjälpa till med implementeringen. Genom att följa dessa steg kan forskare effektivt berika och upptäcka hälso- och sjukvårdspersonal, vilket ökar känsligheten och noggrannheten i riskbedömningen av läkemedelsprodukter.
Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som frigörs från värdorganismens cellkultur och samrenas med monoklonala antikroppar (mAb)1,2,3,4. Spårnivåer av hälso- och sjukvårdspersonal kan ha en negativ inverkan på kvaliteten på läkemedlet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, och därför är en känslig HCP-analysmetod önskvärd för att detektera HCP:er i sub-ppm- till ppm-nivåer.
Ortogonala metoder kan användas för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal i låg förekomst. Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) används i allmänhet för att kvantifiera den totala hälso- och sjukvårdspersonalen, och den kan också detektera och kvantifiera enskilda hälso- och sjukvårdspersonal om motsvarande antikroppar finns tillgängliga16. Produktionen av HCP-specifika antikroppar är dock tidskrävande och arbetskrävande. Däremot kan vätskekromatografi i kombination med masspektrometri (LC-MS) ge omfattande information om enskilda hälso- och sjukvårdspersonal i mAb-läkemedelsprodukter och används i stor utsträckning för HCP-identifiering 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Flera metoder har utvecklats för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal med LC-MS/MS, inklusive begränsad nedbrytning20, filtrering17, protein A-deletion21, immunoprecipitering (IP) och ProteoMiner-anrikning (PM)18. De flesta metoder syftar till att minska mängden mAb och berika hälso- och sjukvårdspersonal före LC-MS/MS-analys, och därigenom minska det dynamiska intervallet mellan mAb-peptider och HCP-peptider. Detta protokoll presenterar en proteomisk provanrikningsmetod som kombinerar ProteoMiner-teknik och begränsad nedbrytning (PMLD)28. ProteoMiner-anrikningsprincipen innebär att man använder kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor som innehåller ett varierat bibliotek av kombinatoriska peptidligander. Dessa ligander binder specifikt till proteiner på antikroppsprodukter, vilket gör det möjligt att avlägsna överflödiga molekyler samtidigt som värdcellsproteiner (HCP) med låg förekomst koncentreras på deras respektive affinitetsligander. Å andra sidan innebär principen om begränsad matsmältning att man använder en låg koncentration av trypsin. Denna koncentration är tillräcklig för att smälta hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst, men inte tillräcklig för att smälta alla antikroppsläkemedel. Detta tillvägagångssätt möjliggör återvinning och anrikning av smälta HCP-peptider från lösningen.
Jämfört med filtreringsmetoder är PMLD-tekniken inte begränsad av storleken på de detekterade hälso- och sjukvårdspersonalen17. Deletionsmetoder för protein A är specifika för att detektera HCP associerade med antikroppar21, medan immunprecipitering är begränsad till fördefinierade HCP:er från en viss cellinje (t.ex. cellinjen Chinese Hamster Ovary (CHO), där en anti-HCP-antikropp genererades4. Däremot kan PMLD användas för att detektera HCP:er från alla läkemedelsmoduler och värdcellsproteiner som samrenats med läkemedelsprodukter från olika cellinjer. Dessutom uppvisar PMLD bättre känslighet jämfört med de nämnda metoderna 17,18,20,21,24.
Detta tillvägagångssätt kan berika HCP-koncentrationen med 7000 gånger och sänka detektionsgränsen till 0,002 ppm28. Den experimentella uppställningen illustreras i figur 1.
Det finns två versioner av kommersiellt tillgängliga proteinberikande pärlor: en med mindre kapacitet och den andra med större kapacitet (se materialtabell). Båda versionerna av berikningspärlorna innehåller tio förberedelser i förpackningen. Tillverkarens instruktioner föreslår att varje förberedelse från det lilla kapacitetspaketet kan användas för att berika 10 mg totalt protein. Men för optimal prestanda för anrikning av värdcellsprotein (HCP) från DS är varje förberedelse bra f?…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
Milli-Q | Millpore | 30035 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |