Evaluación rápida de la citotoxicidad in vitro del receptor de antígeno quimérico que expresa jurkat mediante imágenes fluorescentes
Summary
Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.
Abstract
Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) están a la vanguardia de la oncología. Un CAR se construye a partir de un dominio diana (generalmente un fragmento variable de cadena única, scFv), con un enlazador intracadena que lo acompaña, seguido de un dominio bisagra, transmembrana y coestimulador. La modificación del enlazador intracadena y del dominio de bisagra puede tener un efecto significativo en la muerte mediada por CAR. Teniendo en cuenta las muchas opciones diferentes para cada parte de una construcción CAR, hay un gran número de permutaciones. La fabricación de células CAR-T es un proceso largo y costoso, y la fabricación y prueba de muchas construcciones requiere una gran inversión de tiempo y material. Este protocolo describe una plataforma para evaluar rápidamente las construcciones de CAR optimizadas para bisagras en células Jurkat (CAR-J). Las células Jurkat son una línea de células T inmortalizadas con una alta absorción de lentivirus, lo que permite una transducción eficiente de CAR. Aquí, presentamos una plataforma para evaluar rápidamente CAR-J utilizando un generador de imágenes fluorescente, seguido de la confirmación de la citólisis en células T derivadas de PBMC.
Introduction
La terapia de células CAR-T ha demostrado ser muy prometedora en neoplasias malignas hematológicas, lo que se evidencia en los 6 productos CAR-T aprobados por la FDA desde 2017, según lo informado por el Instituto Nacional del Cáncer1. Existen numerosas células CAR-T en ensayos clínicos para atacar tumores sólidos. La ingeniería de nuevos objetivos CAR y la optimización de la construcción de CAR son vitales para la eficacia de una célula CAR-T. La elección de la construcción de CAR ideal para cada aplicación es esencial para una orientación precisa de los antígenos asociados al tumor (TAA) y, al mismo tiempo, evitar niveles bajos de expresión de TAA en los tejidos normales2.
Una construcción de CAR se compone principalmente de cinco compartimentos: (1) dominio extracelular de fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido al antígeno tumoral; (2) dominio de bisagra; (3) dominio transmembrana; (4) dominio coestimulador intracelular de células T citoplasmáticas; y (5) dominio de señalización. La modificación de cada uno de estos dominios afecta a la precisión de la célula CAR-T que interactúa con su célula diana3. Por lo tanto, la evaluación de la citotoxicidad y la reactividad cruzada de estas construcciones de CAR in vitro es fundamental para elegir la construcción correcta para avanzar hacia experimentos in vivo. Los métodos actuales para evaluar la citólisis por células T incluyen el ensayo de liberación de 51Cr, el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa, el ensayo de imágenes bioluminiscentes, el análisis celular basado en impedancia en tiempo real y el ensayo de citometría de flujo basado en células 4,5. La plataforma basada en imágenes fluorescentes descrita aquí identifica el número de células vivas frente a las muertas, que es una cuantificación directa de la citólisis de células T en lugar de un método indirecto de evaluación de la citólisis por parte de las células T.
Esta es una técnica fácil, rentable, rápida y de alto rendimiento con una intervención mínima para evaluar la citotoxicidad de las células Jurkat que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) CAR contra las células de cáncer de mama triple negativo (TNBC) MDA-MB-231 y las células EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Las células Jurkat son células de linfocitos T humanos inmortalizadas6 que se han utilizado ampliamente para estudiar la activación de las células T y los mecanismos de señalización7. Además, las células Jurkat se han utilizado para pruebas in vitro de CAR en múltiples estudios 8,9,10,11. Las células Jurkat son fácilmente transducidas por lentivirus y tienen una proliferación sostenida, y este sistema se aprovechó para optimizar el dominio de bisagra de varias construcciones de EGFR CAR.
Este ensayo se puede utilizar para el cribado de múltiples construcciones de CAR dirigidas a varios antígenos tumorales y se puede utilizar contra múltiples líneas celulares tumorales adherentes y en varias proporciones efectora-tumoral (E:T). Además, se pueden evaluar múltiples puntos de tiempo y se puede modificar el número de réplicas para identificar la mejor eliminación entre las diversas construcciones de CAR. Los mejores constructos deben confirmarse utilizando células T CD3 derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El objetivo general detrás del desarrollo de este método es optimizar rápidamente la geometría de la bisagra CAR de una manera de alto rendimiento, superando barreras como la baja eficiencia de transducción, seguida de la confirmación en células T derivadas de PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos propuesto un método rápido para evaluar eficientemente la actividad citolítica específica de la diana inducida por la expresión de CAR en células Jurkat. Todas las construcciones de CAR tienen el mismo scFv pero diferentes dominios bisagra y transmembrana que se ha demostrado que afectan a la potencia de las células CAR-T13. La evaluación adicional de la destrucción inespecífica por parte de estos CAR-J se realizó mediante el cultivo con células knock-out de antígenos (KO)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 fue un amable regalo del Dr. Shane Stecklein. Los autores agradecen la financiación del Centro Oncológico de la Universidad de Kansas para llevar a cabo esta investigación.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
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