Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales
Summary
La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.
Abstract
La terapia convencional de regeneración ósea con células madre mesenquimales (MSC) es difícil de aplicar a defectos óseos más grandes que el tamaño crítico porque no tiene un mecanismo para inducir la angiogénesis. La implantación de tejido cartilaginoso artificial fabricado a partir de MSC induce la angiogénesis y la formación ósea in vivo a través de la osificación endocondral (ECO). Por lo tanto, este enfoque mediado por ECO puede ser una terapia de regeneración ósea prometedora en el futuro. Un aspecto importante de la aplicación clínica de este enfoque mediado por ECO es el establecimiento de un protocolo para preparar suficiente cartílago para ser implantado para reparar el defecto óseo. Especialmente no es práctico diseñar una sola masa de cartílago injertado de un tamaño que se ajuste a la forma del defecto óseo real. Por lo tanto, el cartílago a trasplantar debe tener la propiedad de formar hueso de forma integral cuando se implantan múltiples piezas. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral con el fin de cumplir con los requisitos clínicos. Aunque muchos hidrogeles de origen natural apoyan la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo, aún no se ha determinado el material de andamio óptimo para satisfacer las necesidades de las aplicaciones clínicas. El ácido hialurónico (AH) es un componente crucial de la matriz extracelular del cartílago y es un polisacárido biodegradable y biocompatible. Aquí, demostramos que los hidrogeles de HA tienen excelentes propiedades para apoyar la diferenciación in vitro del tejido cartilaginoso basado en MSC y promover la formación de hueso endocondral in vivo.
Introduction
El hueso autólogo sigue siendo el estándar de oro para reparar defectos óseos debidos a traumatismos, defectos congénitos y resección quirúrgica. Sin embargo, el injerto óseo autógeno tiene limitaciones significativas, incluyendo dolor del donante, riesgo de infección y volumen óseo limitado que puede ser aislado de los pacientes 1,2,3,4. Se han desarrollado numerosos biomateriales como sustitutos óseos, combinando polímeros naturales o sintéticos con materiales mineralizados como el fosfato cálcico o la hidroxiapatita 5,6. La formación ósea en estos materiales de ingeniería generalmente se logra utilizando el material mineralizado como material de cebado para permitir que las células madre se diferencien directamente en osteoblastos a través del proceso de osificación intramembrana (IMO)7. Este proceso carece de la etapa angiogénica, lo que resulta en una vascularización in vivo insuficiente del injerto después de la implantación 8,9,10 y, por lo tanto, los abordajes que utilizan dicho proceso pueden no ser óptimos para el tratamiento de grandes defectos óseos 11.
Se ha demostrado que las estrategias aplicadas para recapitular el proceso de osificación endocondral (ECO), un mecanismo innato en la esquelectogénesis durante el desarrollo, superan problemas significativos asociados con los enfoques tradicionales basados en OMI. En la ECO, los condrocitos de la plantilla del cartílago liberan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que promueve la infiltración vascular y la remodelación de la plantilla del cartílago en el hueso12. El enfoque mediado por ECO para la osteogénesis a través de la remodelación del cartílago y la angiogénesis, que también se activa durante la reparación de fracturas, utiliza tejido cartilaginoso creado artificialmente derivado de MSC como material de cebado. Los condrocitos pueden tolerar la hipoxia en defectos óseos, inducir angiogénesis y convertir un injerto de cartílago libre vascular en tejido angiogénico. Numerosos estudios han reportado que los injertos de cartílago basados en MSC generan hueso in vivo mediante la implementación de un programa ECO de este tipo 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Un requisito esencial para la aplicación clínica de este enfoque ecomediado es cómo preparar la cantidad deseada de injerto de cartílago en un entorno clínico. Preparar cartílago clínico de un tamaño que se ajuste al defecto óseo real no es práctico. Por lo tanto, el cartílago del injerto debe formar hueso integralmente cuando se implantan múltiples fragmentos22. Los hidrogeles pueden ser una herramienta atractiva para ampliar los injertos de ingeniería tisular para la osificación endocondral. Muchos hidrogeles de origen natural favorecen la formación de cartílago MSC in vitro y ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; sin embargo, aún no se ha determinado el material de soporte óptimo para cumplir con los requisitos de la aplicación clínica. El ácido hialurónico (AH) es un polisacárido biodegradable y biocompatible presente en la matriz extracelular del cartílago33. El AH interactúa con las MSC a través de receptores de superficie como CD44 para apoyar la diferenciación condrogénica 25,26,28,30,31,32,34. Además, los andamios de AH promueven la diferenciación osteogénica mediada por IMO de las células madre de la pulpa dental humana35, y los andamios combinados con colágeno promueven la osteogénesis mediada por ECO36,37.
En este trabajo se presenta un método para la preparación de hidrogeles de AH utilizando MSCs humanas adultas derivadas de la médula ósea y su uso para la condrogénesis hipertrófica in vitro y la posterior osificación endocondral in vivo38. Comparamos las características del AH con las del colágeno, un material ampliamente aplicado en la ingeniería de tejidos óseos con MSCs y un material útil para el escalado de injertos artificiales para la osificación endocondral17. En un modelo de ratón inmunodeprimido, se evaluó el potencial de ECO in vivo de las construcciones de AH y colágeno sembradas con MSC humanas mediante implantación subcutánea. Los resultados muestran que los hidrogeles de HA son excelentes como andamio para que las MSC creen injertos de cartílago artificial que permitan la formación de hueso a través de ECO.
El protocolo se divide en dos pasos. En primer lugar, se preparan construcciones de MSC humanas sembradas en hidrogel de hialuronano y se diferencian en cartílago hipertrófico in vitro. A continuación, las construcciones diferenciadas se implantan por vía subcutánea en un modelo desnudo para inducir la osificación endocondral in vivo (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de materiales de andamiaje apropiados que promuevan la transición del cartílago hipertrófico al hueso es un enfoque prometedor para ampliar los injertos de cartílago hipertrófico diseñados basados en MSC y tratar defectos óseos de tamaño clínicamente significativo. Aquí, mostramos que el AH es un excelente material de andamiaje para apoyar la diferenciación del tejido cartilaginoso hipertrófico basado en MSC in vitro y para promover la formación de hueso endocondral in vivo<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de una subvención para la investigación científica (KAKENHI) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (subvención nos. JP19K10259 y 22K10032 al MAI).
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
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