JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

تشكيل العظام المتكاملة من خلال التعظم داخل الغضروف في الجسم الحي باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65573
, , ,
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences,Tokyo Medical and Dental University

Summary

علاج العظام عن طريق التعظم داخل الغضروف عن طريق زرع أنسجة الغضاريف الاصطناعية المنتجة من الخلايا الجذعية الوسيطة لديه القدرة على التحايل على عيوب العلاجات التقليدية. الهلاميات المائية لحمض الهيالورونيك فعالة في توسيع نطاق ترقيع الغضاريف المتمايزة بشكل موحد بالإضافة إلى إنشاء عظام متكاملة مع الأوعية الدموية بين الطعوم المنصهرة في الجسم الحي.

Abstract

من الصعب تطبيق العلاج التقليدي لتجديد العظام باستخدام الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على عيوب العظام الأكبر من الحجم الحرج لأنه لا يحتوي على آلية للحث على تكوين الأوعية. يؤدي زرع أنسجة الغضاريف الاصطناعية المصنعة من MSCs إلى تكوين الأوعية الدموية وتكوين العظام في الجسم الحي عن طريق التعظم داخل الغضروف (ECO). لذلك ، قد يكون هذا النهج بوساطة منظمة التعاون البيئي علاجا واعدا لتجديد العظام في المستقبل. يتمثل أحد الجوانب المهمة للتطبيق السريري لهذا النهج بوساطة ECO في إنشاء بروتوكول لإعداد ما يكفي من الغضروف ليتم زرعه لإصلاح عيب العظام. ليس من العملي بشكل خاص تصميم كتلة واحدة من الغضروف المطعمة بحجم يتوافق مع شكل عيب العظم الفعلي. لذلك ، يجب أن يكون للغضروف المراد زرعه خاصية تكوين العظام بشكل متكامل عند زرع قطع متعددة. قد تكون الهلاميات المائية أداة جذابة لتوسيع نطاق الطعوم المهندسة بالأنسجة من أجل التعظم داخل الغضروف لتلبية المتطلبات السريرية. على الرغم من أن العديد من الهلاميات المائية المشتقة بشكل طبيعي تدعم تكوين غضروف MSC في المختبر و ECO في الجسم الحي ، إلا أن مادة السقالة المثلى لتلبية احتياجات التطبيقات السريرية لم يتم تحديدها بعد. حمض الهيالورونيك (HA) هو عنصر حاسم في مصفوفة الغضروف خارج الخلية وهو عديد السكاريد القابل للتحلل الحيوي والمتوافق حيويا. هنا ، نظهر أن الهلاميات المائية HA لها خصائص ممتازة لدعم التمايز في المختبر لأنسجة الغضاريف القائمة على MSC وتعزيز تكوين العظام داخل الغضروف في الجسم الحي.

Introduction

لا يزال العظم الذاتي هو المعيار الذهبي لإصلاح عيوب العظام بسبب الصدمات والعيوب الخلقية والاستئصال الجراحي. ومع ذلك ، فإن تطعيم العظام الذاتي له قيود كبيرة ، بما في ذلك ألم المتبرع ، وخطر العدوى ، وحجم العظام المحدود الذي يمكن عزله عن المرضى1،2،3،4. تم تطوير العديد من المواد الحيوية كبدائل للعظام ، تجمع بين البوليمرات الطبيعية أو الاصطناعية والمواد المعدنية مثل فوسفات الكالسيوم أو هيدروكسيباتيت 5,6. عادة ما يتم تحقيق تكوين العظام في هذه المواد الهندسية باستخدام المواد المعدنية كمادة أولية للسماح للخلايا الجذعية بالتمايز مباشرة إلى بانيات العظم من خلال عملية التعظم داخل الغشاء (IMO)7. تفتقر هذه العملية إلى الخطوة الوعائية ، مما يؤدي إلى عدم كفاية الأوعية الدموية في الجسم الحي للكسب غير المشروع بعد الزرع8،9،10 ، وبالتالي ، قد لا تكون الطرق التي تستخدم مثل هذه العملية هي الأمثل لعلاج عيوب العظام الكبيرة 11.

وقد ثبت أن الاستراتيجيات المطبقة لتلخيص عملية التعظم داخل الغضروف (ECO) ، وهي آلية فطرية في تكوين الهيكل العظمي أثناء التطور ، تتغلب على المشاكل الكبيرة المرتبطة بالنهج التقليدية القائمة على المنظمة البحرية الدولية. في ECO ، تطلق الخلايا الغضروفية في قالب الغضروف عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ، مما يعزز تسلل الأوعية الدموية وإعادة تشكيل قالب الغضروف إلى العظم12. يستخدم النهج بوساطة ECO لتكوين العظم عن طريق إعادة تشكيل الغضروف وتكوين الأوعية ، والذي يتم تنشيطه أيضا أثناء إصلاح الكسر ، أنسجة غضروفية تم إنشاؤها بشكل مصطنع مشتقة من MSCs كمادة أولية. يمكن للخلايا الغضروفية تحمل نقص الأكسجة في عيوب العظام ، والحث على تكوين الأوعية الدموية ، وتحويل طعم الغضروف الخالي من الأوعية الدموية إلى نسيج وعائي. أفادت العديد من الدراسات أن ترقيع الغضروف القائم على MSC يولد العظام في الجسم الحي من خلال تنفيذ مثل هذا البرنامج ECO 13،14،15،16،17،18،19،20،21.

أحد المتطلبات الأساسية للتطبيق السريري لهذا النهج بوساطة منظمة التعاون البيئي هو كيفية تحضير الكمية المطلوبة من طعم الغضروف في بيئة سريرية. إعداد الغضروف السريري بحجم يناسب عيب العظام الفعلي ليس عمليا. لذلك ، يجب أن يشكل غضروف الكسب غير المشروع العظام بشكل متكامل عند زرع شظايا متعددة22. قد تكون الهلاميات المائية أداة جذابة لتوسيع نطاق الطعوم المهندسة بالأنسجة من أجل التعظم داخل الغضروف. تدعم العديد من الهلاميات المائية المشتقة بشكل طبيعي تكوين غضروف MSC في المختبر و ECO في الجسم الحي23،24،25،26،27،28،29،30،31،32 ؛ ومع ذلك ، ظلت مواد الدعم المثلى لتلبية متطلبات التطبيق السريري غير محددة. حمض الهيالورونيك (HA) هو عديد السكاريد القابل للتحلل الحيوي والمتوافق حيويا الموجود في المصفوفة خارج الخلية للغضروف33. يتفاعل HA مع MSCs عبر مستقبلات سطحية مثل CD44 لدعم التمايز الغضروفي25،26،28،30،31،32،34. بالإضافة إلى ذلك ، تعزز سقالات HA التمايز العظمي بوساطة المنظمة البحرية الدولية للخلايا الجذعية لب الأسنانالبشرية 35 ، والسقالات جنبا إلى جنب مع الكولاجين تعزز تكوين العظم بوساطة ECO-36,37.

هنا ، نقدم طريقة لإعداد الهلاميات المائية HA باستخدام MSCs البشرية البالغة المشتقة من نخاع العظم واستخدامها لتكوين الغضروف الضخامي في المختبر والتعظم داخل الغضروفي اللاحق في الجسم الحي38. قارنا خصائص HA مع خصائص الكولاجين ، وهي مادة مطبقة على نطاق واسع في هندسة أنسجة العظام مع MSCs ومادة مفيدة لتوسيع نطاق الطعوم الاصطناعية للتعظم داخل الغضروف17. في نموذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، تم تقييم تركيبات HA والكولاجين المصنفة مع MSCs البشرية لإمكانات ECO في الجسم الحي عن طريق الزرع تحت الجلد. تظهر النتائج أن الهلاميات المائية HA ممتازة كسقالة ل MSCs لإنشاء ترقيع غضروفي اصطناعي يسمح بتكوين العظام من خلال ECO.

ينقسم البروتوكول إلى خطوتين. أولا ، يتم تحضير تركيبات MSCs البشرية المصنفة على هيدروجيل الهيالورونان وتمييزها إلى غضروف ضخامي في المختبر. بعد ذلك ، يتم زرع التركيبات المتمايزة تحت الجلد في نموذج عاري للحث على التعظم داخل الغضروف في الجسم الحي (الشكل 1).

Protocol

يستخدم هذا البروتوكول ذكور الفئران العارية البالغة من العمر 4 أسابيع. إيواء أربعة فئران في قفص تحت دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة نسبية 50٪ -70٪. أجريت جميع التجارب على وفقا للإرشادات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة طوكيو للطب وطب الأسنان (معر?…

Representative Results

تم استزراع الهلاميات المائية HA المغلفة MSC في وسط غضروفي مكمل ب TGFβ3 ، وهو محفز لتكوين الغضروف41 (الخطوة 4.1). قارنا خصائص HA مع خصائص الكولاجين ، والتي أثبتت فعاليتها في إنشاء ترقيع غضروفي اصطناعي قائم على MSC للتعظم داخل الغضروف ، كما هو موضح سابقا38. لم يتم تضمين MSCs غير ا…

Discussion

يعد استخدام مواد السقالة المناسبة التي تعزز الانتقال من الغضروف الضخامي إلى العظام نهجا واعدا لتوسيع نطاق ترقيع الغضروف الضخامي الهندسي القائم على MSC وعلاج عيوب العظام ذات الحجم الكبير سريريا. هنا ، نظهر أن HA هي مادة سقالة ممتازة لدعم تمايز أنسجة الغضاريف الضخامية القائمة على MSC في المخ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة في المعونة للبحث العلمي (KAKENHI) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (رقم المنحة . JP19K10259 و 22K10032 إلى MAI).

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical  209-16941
Antisedan Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate Nacalai Tesque 13571-14
Bambanker GC Lymphotec CS-02-001
basic fibroblastic growth factor Reprocell RCHEOT002 
bovine serum albumin FUJIFILM Wako Pure Chemical  012-23881 7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10283
dexamethasone Merck D8893
Domitor Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck D6429 high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Merck D6421
Fetal bovine serum Hyclone SH30396.03
Gentamicin sulfate FUJIFILM Wako Pure Chemical  1676045  10 mg/mL
Haccpper Generator TechnoMax CH-400-5QB 50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit Merck HYS020
IL-1ß PeproTech AF-200-01B
ITS-G supplement FUJIFILM Wako Pure Chemical  090-06741 ×100
L-Alanyl-L-Glutamine FUJIFILM Wako Pure Chemical  016-21841 200mmol/L (×100)
L-proline Nacalai Tesque 29001-42
L-Thyroxine Merck T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		 Lonza PT-3001
paraffin FUJIFILM Wako Pure Chemical  165-13375
PBS / pH7.4 100ml Medicago 09-2051-100
TGF-β3  Proteintech HZ-1090
Vetorphale Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate FUJIFILM Wako Pure Chemical  048-34332
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, V. M., Stevenson, S. Natural history of autografts and allografts. Clinical Orthopaedics and Related Research. (225), 7-16 (1987).
  2. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  3. Vining, N. C., Warme, W. J., Mosca, V. S. Comparison of structural bone autografts and allografts in pediatric foot surgery. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 32 (7), 719-723 (2012).
  4. Roddy, E., DeBaun, M. R., Daoud-Gray, A., Yang, Y. P., Gardner, M. J. Treatment of critical-sized bone defects: clinical and tissue engineering perspectives. European Journal of Orthopaedic Surgery and Traumatology. 28 (3), 351-362 (2018).
  5. Rezwan, K., Chen, Q. Z., Blaker, J. J., Boccaccini, A. R. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  6. Swetha, M., et al. Biocomposites containing natural polymers and hydroxyapatite for bone tissue engineering. International Journal of Biological Macromolecules. 47 (1), 1-4 (2010).
  7. Meijer, G. J., de Bruijn, J. D., Koole, R., van Blitterswijk, C. A. Cell-based bone tissue engineering. PLOS Medicine. 4 (2), e9 (2007).
  8. Tremblay, P. L., Hudon, V., Berthod, F., Germain, L., Auger, F. A. Inosculation of tissue-engineered capillaries with the host’s vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice. American Journal of Transplantation. 5 (5), 1002-1010 (2005).
  9. Ko, H. C., Milthorpe, B. K., McFarland, C. D. Engineering thick tissues–the vascularisation problem. European Cells and Materials. 14, 1-19 (2007).
  10. Santos, M. I., Reis, R. L. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience. 10 (1), 12-27 (2010).
  11. Almubarak, S., et al. Tissue engineering strategies for promoting vascularized bone regeneration. Bone. 83, 197-209 (2016).
  12. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  13. Farrell, E., et al. Chondrogenic priming of human bone marrow stromal cells: a better route to bone repair. Tissue Engineering Part C: Methods. 15 (2), 285-295 (2009).
  14. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  15. Janicki, P., Kasten, P., Kleinschmidt, K., Luginbuehl, R., Richter, W. Chondrogenic pre-induction of human mesenchymal stem cells on beta-TCP: enhanced bone quality by endochondral heterotopic bone formation. Acta Biomaterialia. 6 (8), 3292-3301 (2010).
  16. Farrell, E., et al. In-vivo generation of bone via endochondral ossification by in-vitro chondrogenic priming of adult human and rat mesenchymal stem cells. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 31 (2011).
  17. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  18. Harada, N., et al. Bone regeneration in a massive rat femur defect through endochondral ossification achieved with chondrogenically differentiated MSCs in a degradable scaffold. Biomaterials. 35 (27), 7800-7810 (2014).
  19. van der Stok, J., et al. Chondrogenically differentiated mesenchymal stromal cell pellets stimulate endochondral bone regeneration in critical-sized bone defects. European Cells and Materials. 27, 137-148 (2014).
  20. Sheehy, E. J., Vinardell, T., Toner, M. E., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Altering the architecture of tissue engineered hypertrophic cartilaginous grafts facilitates vascularisation and accelerates mineralisation. PLoS One. 9 (3), e90716 (2014).
  21. Sheehy, E. J., Mesallati, T., Vinardell, T., Kelly, D. J. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels. Acta Biomaterialia. 13, 245-253 (2015).
  22. Bahney, C. S., et al. Stem cell-derived endochondral cartilage stimulates bone healing by tissue transformation. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (5), 1269-1282 (2014).
  23. Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14 (2), 179-189 (2006).
  24. Dickhut, A., Gottwald, E., Steck, E., Heisel, C., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in gel-like biomaterials in vitro and in vivo. Frontiers in Bioscience. 13, 4517-4528 (2008).
  25. Chung, C., Burdick, J. A. Influence of three-dimensional hyaluronic acid microenvironments on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 243-254 (2009).
  26. Erickson, I. E., et al. Macromer density influences mesenchymal stem cell chondrogenesis and maturation in photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels. Osteoarthritis Cartilage. 17 (12), 1639-1648 (2009).
  27. Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stem cells undergoing chondrogenesis in agarose hydrogels of solid and channelled architectures respond differentially to dynamic culture conditions. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5 (9), 747-758 (2011).
  28. Erickson, I. E., et al. High mesenchymal stem cell seeding densities in hyaluronic acid hydrogels produce engineered cartilage with native tissue properties. Acta Biomaterialia. 8 (8), 3027-3034 (2012).
  29. Ma, K., Titan, A. L., Stafford, M., Zheng, C., Levenston, M. E. Variations in chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in fibrin/alginate blended hydrogels. Acta Biomaterialia. 8 (10), 3754-3764 (2012).
  30. Levett, P. A., et al. A biomimetic extracellular matrix for cartilage tissue engineering centered on photocurable gelatin, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Acta Biomaterialia. 10 (1), 214-223 (2014).
  31. Reppel, L., et al. Chondrogenic induction of mesenchymal stromal/stem cells from Wharton’s jelly embedded in alginate hydrogel and without added growth factor: an alternative stem cell source for cartilage tissue engineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 260 (2015).
  32. Amann, E., Wolff, P., Breel, E., van Griensven, M., Balmayor, E. R. Hyaluronic acid facilitates chondrogenesis and matrix deposition of human adipose derived mesenchymal stem cells and human chondrocytes co-cultures. Acta Biomaterialia. 52, 130-144 (2017).
  33. Hemshekhar, M., et al. Emerging roles of hyaluronic acid bioscaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. International Journal of Biological Macromolecules. 86, 917-928 (2016).
  34. Pfeifer, C. G., et al. Higher Ratios of Hyaluronic Acid Enhance Chondrogenic Differentiation of Human MSCs in a Hyaluronic Acid-Gelatin Composite Scaffold. Materials (Basel). 9 (5), (2016).
  35. La Noce, M., et al. Hyaluronan-Based Gel Promotes Human Dental Pulp Stem Cells Bone Differentiation by Activating YAP/TAZ Pathway. Cells. 10 (11), (2021).
  36. Thompson, E. M., Matsiko, A., Kelly, D. J., Gleeson, J. P., O’Brien, F. J. An Endochondral Ossification-Based Approach to Bone Repair: Chondrogenically Primed Mesenchymal Stem Cell-Laden Scaffolds Support Greater Repair of Critical-Sized Cranial Defects Than Osteogenically Stimulated Constructs In Vivo. Tissue Engineering Part A. 22 (5-6), 556-567 (2016).
  37. Wang, H., et al. Cell-mediated injectable blend hydrogel-BCP ceramic scaffold for in situ condylar osteochondral repair. Acta Biomaterialia. 123, 364-378 (2021).
  38. Yamazaki, S., et al. Hyaluronic acid hydrogels support to generate integrated bone formation through endochondral ossification in vivo using mesenchymal stem cells. PLoS One. 18 (2), e0281345 (2023).
  39. Zarembinski, T., Skardal, A. . Hydrogels – Smart Materials for Biomedical Applications. , (2019).
  40. Vinardell, T., Sheehy, E. J., Buckley, C. T., Kelly, D. J. A comparison of the functionality and in vivo phenotypic stability of cartilaginous tissues engineered from different stem cell sources. Tissue Engineering Part A. 18 (11-12), 1161-1170 (2012).
  41. Mueller, M. B., et al. Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning. Cells Tissues Organs. 192 (3), 158-166 (2010).
  42. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  43. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  44. Chan, C. K., et al. Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature. 457 (7228), 490-494 (2009).
  45. Murdoch, A. D., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow stem cells in transwell cultures: generation of scaffold-free cartilage. Stem Cells. 25 (11), 2786-2796 (2007).
  46. Tortelli, F., Tasso, R., Loiacono, F., Cancedda, R. The development of tissue-engineered bone of different origin through endochondral and intramembranous ossification following the implantation of mesenchymal stem cells and osteoblasts in a murine model. Biomaterials. 31 (2), 242-249 (2010).
  47. Knuth, C. A., Witte-Bouma, J., Ridwan, Y., Wolvius, E. B., Farrell, E. Mesenchymal stem cell-mediated endochondral ossification utilising micropellets and brief chondrogenic priming. European Cells and Materials. 34, 142-161 (2017).
  48. Simmons, C. A., Alsberg, E., Hsiong, S., Kim, W. J., Mooney, D. J. Dual growth factor delivery and controlled scaffold degradation enhance in vivo bone formation by transplanted bone marrow stromal cells. Bone. 35 (2), 562-569 (2004).

Tags

Mesenchymal Stem CellsBone FormationIn VivoEndochondral OssificationArtificial CartilageBone RegenerationAngiogenesisScaffoldCartilage DifferentiationCritical Size Bone DefectECO-mediated Approach
check_url/fr/65573?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yamazaki, S., Lin, Y., Marukawa, E., Ikeda, M. Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (197), e65573, doi:10.3791/65573 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image