Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Summary

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Abstract

Die konventionelle Knochenregenerationstherapie mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) ist bei Knochendefekten, die größer als die kritische Größe sind, schwierig anzuwenden, da sie keinen Mechanismus zur Induktion der Angiogenese hat. Die Implantation von künstlichem Knorpelgewebe, das aus MSCs hergestellt wird, induziert die Angiogenese und Knochenbildung in vivo durch endochondrale Ossifikation (ECO). Daher könnte dieser ECO-vermittelte Ansatz in Zukunft eine vielversprechende Knochenregenerationstherapie sein. Ein wichtiger Aspekt der klinischen Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Erstellung eines Protokolls zur Vorbereitung von genügend Knorpel für die Implantation zur Reparatur des Knochendefekts. Insbesondere ist es nicht praktikabel, eine einzelne Masse aus transplantiertem Knorpel in einer Größe zu entwerfen, die der Form des tatsächlichen Knochendefekts entspricht. Daher muss der zu transplantierende Knorpel die Eigenschaft haben, bei der Implantation mehrerer Stücke Knochen integral zu bilden. Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden. Obwohl viele natürlich gewonnene Hydrogele die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo unterstützen, muss das optimale Gerüstmaterial für die Anforderungen klinischer Anwendungen noch bestimmt werden. Hyaluronsäure (HA) ist ein entscheidender Bestandteil der extrazellulären Matrix des Knorpels und ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid. Hier zeigen wir, dass HA-Hydrogele hervorragende Eigenschaften haben, um die in vitro Differenzierung von MSC-basiertem Knorpelgewebe zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern.

Introduction

Autologer Knochen ist nach wie vor der Goldstandard für die Reparatur von Knochendefekten aufgrund von Traumata, angeborenen Defekten und chirurgischer Resektion. Die autogene Knochentransplantation hat jedoch erhebliche Einschränkungen, einschließlich Spenderschmerzen, Infektionsrisiko und begrenztes Knochenvolumen, das von den Patienten isoliert werden kann 1,2,3,4. Als Knochenersatz wurden zahlreiche Biomaterialien entwickelt, die natürliche oder synthetische Polymere mit mineralisierten Materialien wie Kalziumphosphat oder Hydroxylapatit^{kombinieren 5,6}. Die Knochenbildung in diesen technischen Materialien wird in der Regel durch die Verwendung des mineralisierten Materials als Priming-Material erreicht, damit sich Stammzellen durch den Intramembran-Ossifikationsprozess (IMO) direkt in Osteoblasten differenzieren^{können 7}. Bei diesem Prozess fehlt der angiogene Schritt, was zu einer unzureichenden In-vivo-Vaskularisierung des Transplantats nach der Implantation führt ^8,9,10, und daher sind Ansätze^, die ein solches Verfahren verwenden, möglicherweise nicht optimal für die Behandlung großer Knochendefekte ¹¹.

Es hat sich gezeigt, dass Strategien, die zur Rekapitulation des endochondralen Ossifikationsprozesses (ECO), einem angeborenen Mechanismus der Skelettgenese während der Entwicklung, angewendet werden, erhebliche Probleme überwinden, die mit traditionellen IMO-basierten Ansätzen verbunden sind. Bei ECO setzen Chondrozyten in der Knorpelschablone den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) frei, der die vaskuläre Infiltration und den Umbau der Knorpelschablone in Knochen fördert¹². Der ECO-vermittelte Ansatz zur Osteogenese über Knorpelumbau und Angiogenese, der auch bei der Frakturreparatur aktiviert wird, verwendet künstlich erzeugtes Knorpelgewebe, das aus MSCs gewonnen wird, als Priming-Material. Chondrozyten können Hypoxie bei Knochendefekten tolerieren, Angiogenese induzieren und ein gefäßfreies Knorpeltransplantat in angiogenes Gewebe umwandeln. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass MSC-basierte Knorpeltransplantate Knochen in vivo erzeugen, indem sie ein solches ECO-Programm implementieren 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Eine wesentliche Voraussetzung für die klinische Anwendung dieses ECO-vermittelten Ansatzes ist die Herstellung der gewünschten Menge an Knorpeltransplantaten in einem klinischen Umfeld. Die Herstellung von klinischem Knorpel in einer Größe, die zum tatsächlichen Knochendefekt passt, ist nicht praktikabel. Daher muss Transplantatknorpel Knochen integral bilden, wenn mehrere Fragmente implantiert werden²². Hydrogele können ein attraktives Werkzeug für die Skalierung von Tissue-Engineering-Transplantaten für die endochondrale Ossifikation sein. Viele natürlich gewonnene Hydrogele unterstützen die MSC-Knorpelbildung in vitro und ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Das optimale Trägermaterial, um die Anforderungen der klinischen Anwendung zu erfüllen, ist jedoch noch nicht festgelegt. Hyaluronsäure (HA) ist ein biologisch abbaubares und biokompatibles Polysaccharid, das in der extrazellulären Matrix des Knorpels^{vorkommt 33}. HA interagiert mit MSCs über Oberflächenrezeptoren wie CD44, um die chondrogene Differenzierung zu unterstützen 25,26,28,30,31,32,34. Darüber hinaus fördern HA-Scaffolds die IMO-vermittelte osteogene Differenzierung von Stammzellen der menschlichen Zahnpulpa³⁵ und Scaffolds in Kombination mit Kollagen die ECO-vermittelte Osteogenese^36,37.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Herstellung von HA-Hydrogelen unter Verwendung von aus dem Knochenmark gewonnenen adulten humanen MSCs vor und ihre Verwendung für die hypertrophe Chondrogenese in vitro und die anschließende endochondrale Ossifikation in vivo³⁸. Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, einem Material, das im Bone Tissue Engineering mit MSCs weit verbreitet ist und ein nützliches Material für die Skalierung künstlicher Transplantate für die endochondrale Ossifikation ist¹⁷. In einem immungeschwächten Mausmodell wurden HA- und Kollagenkonstrukte, die mit humanen MSCs ausgesät waren, durch subkutane Implantation auf ihr in vivo ECO-Potenzial untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass HA-Hydrogele hervorragend als Gerüst für MSCs geeignet sind, um künstliche Knorpeltransplantate herzustellen, die die Knochenbildung durch ECO ermöglichen.

Das Protokoll gliedert sich in zwei Schritte. Zunächst werden Konstrukte von humanen MSCs, die auf Hyaluron-Hydrogel ausgesät sind, hergestellt und in vitro zu hypertrophem Knorpel differenziert. Als nächstes werden die differenzierten Konstrukte subkutan in ein Nacktmodell implantiert, um eine endochondrale Ossifikation in vivo zu induzieren (Abbildung 1).

Protocol

Bei diesem Protokoll werden 4 Wochen alte männliche Nacktmäuse verwendet. Halten Sie vier Mäuse in einem Käfig unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 22−24 °C und 50%−70% relativer Luftfeuchtigkeit. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Tokyo Medical and Dental University genehmigt wurden (Zulassungs-ID: A2019-204C, A2020-116A und A2021-121A). 1. Herstellung von Puffern un…

Representative Results

MSC-verkapselte HA-Hydrogele wurden in chondrogenem Medium kultiviert, das mit TGFβ3, einem Induktor der Chondrogenese41 , ergänzt wurde (Schritt 4.1). Wir verglichen die Eigenschaften von HA mit denen von Kollagen, das sich als wirksam bei der Herstellung von MSC-basierten künstlichen Knorpeltransplantaten für die endochondrale Ossifikation erwiesen hat, wie zuvor beschrieben38. Undifferenzierte MSCs wurden nicht als Negativkontrollen in diese Studie einbezogen, da gez…

Discussion

Die Verwendung geeigneter Gerüstmaterialien, die den Übergang vom hypertrophen Knorpel zum Knochen fördern, ist ein vielversprechender Ansatz, um MSC-basierte hypertrophe Knorpeltransplantate zu skalieren und Knochendefekte klinisch signifikanter Größe zu behandeln. Hier zeigen wir, dass HA ein hervorragendes Gerüstmaterial ist, um die Differenzierung von MSC-basiertem hypertrophem Knorpelgewebe in vitro zu unterstützen und die endochondrale Knochenbildung in vivo zu fördern ^38…

Materials

0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332