Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

Summary

La thérapie osseuse par ossification endochondrale par implantation de tissu cartilagineux artificiel produit à partir de cellules souches mésenchymateuses a le potentiel de contourner les inconvénients des thérapies conventionnelles. Les hydrogels d’acide hyaluronique sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffes de cartilage uniformément différenciées ainsi que pour créer un os intégré avec vascularisation entre les greffons fusionnés in vivo.

Abstract

La thérapie conventionnelle de régénération osseuse utilisant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est difficile à appliquer aux défauts osseux supérieurs à la taille critique, car elle n’a pas de mécanisme pour induire l’angiogenèse. L’implantation de tissu cartilagineux artificiel fabriqué à partir de CSM induit l’angiogenèse et la formation osseuse in vivo via l’ossification endochondrale (ECO). Par conséquent, cette approche médiée par l’ECO peut être une thérapie de régénération osseuse prometteuse à l’avenir. Un aspect important de l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est l’établissement d’un protocole de préparation d’une quantité suffisante de cartilage à implanter pour réparer le défaut osseux. Il n’est surtout pas pratique de concevoir une seule masse de cartilage greffé d’une taille conforme à la forme du défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage à transplanter doit avoir la propriété de former de l’os intégralement lorsque plusieurs morceaux sont implantés. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale afin de répondre aux exigences cliniques. Bien que de nombreux hydrogels d’origine naturelle favorisent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo, le matériau d’échafaudage optimal pour répondre aux besoins des applications cliniques n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un composant crucial de la matrice extracellulaire cartilagineuse et est un polysaccharide biodégradable et biocompatible. Ici, nous montrons que les hydrogels d’AH ont d’excellentes propriétés pour soutenir la différenciation in vitro du tissu cartilagineux à base de CSM et favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo.

Introduction

L’os autologue est toujours la référence en matière de réparation des défauts osseux dus à des traumatismes, des malformations congénitales et de la résection chirurgicale. Cependant, la greffe osseuse autogène présente des limites importantes, notamment la douleur du donneur, le risque d’infection et le volume osseux limité qui peut être isolé des patients 1,2,3,4. De nombreux biomatériaux ont été développés comme substituts osseux, combinant des polymères naturels ou synthétiques avec des matériaux minéralisés tels que le phosphate de

Protocol

Ce protocole utilise des souris nues mâles âgées de 4 semaines. Hébergez quatre souris dans une cage soumise à un cycle lumière/obscurité de 12 h à 22−24 °C et à une humidité relative de 50 % à 70 %. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale et dentaire de Tokyo (ID d’approbation : A2019-204C, A2020-116A et A2021-121A).

1. Préparation des tampons et des réactifs

1. Préparez le milieu de croissance des cellules souches mésenchymateuses (milieu de croissance MSC) en ajoutant le ....

Results

Les hydrogels d’AH encapsulés dans MSC ont été cultivés dans un milieu chondrogénique supplémenté en TGFβ3, un inducteur de la chondrogenèse⁴¹ (étape 4.1). Nous avons comparé les propriétés de l’AH avec celles du collagène, qui s’est avéré efficace dans la création de greffes de cartilage artificiel à base de CSM pour l’ossification endochondrale, comme décrit précédemment³⁸. Les CSM indifférenciées n’ont pas été incluses comme témoins négatifs dans cette étude, car il a ét.......

Discussion

L’utilisation de matériaux d’échafaudage appropriés qui favorisent la transition du cartilage hypertrophique à l’os est une approche prometteuse pour mettre à l’échelle les greffes de cartilage hypertrophique à base de CSM et traiter les défauts osseux de taille cliniquement significative. Ici, nous montrons que l’AH est un excellent matériau d’échafaudage pour soutenir la différenciation du tissu cartilagineux hypertrophique à base de CSM in vitro et pour favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 w/v % de trypsine-1 mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
facteur de croissance fibroblastique de base	Reprocell	RCHEOT002  ;
albumine sérique bovine	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	012-23881	7,5 w/v %
Compteur de cellules automatisé Countess avec lames de chambre de comptage de cellules et coloration au bleu trypan 0,4	Invitrogen	C10283
dexaméthasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Merck	D6429	haute teneur en glucose
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Sérum de veau fœtal	Hyclone	SH30396.03
Sulfate de gentamicine	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	1676045	; 10 mg/mL
Générateur Haccpper	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm eau acide hypochloreuse
Cellules souches mésenchymateuses humaines	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß ;	PeproTech	AF-200-01B
Supplément ITS-G	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	090-06741	&Times ; 100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chimique  ;	016-21841	200mmol/L (&fois ; 100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffine	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-&beta ; 3  ;	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Pommade	SAVAVET/SAVA Healthcare
&beta ;-glycérophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical  ;	Référence 048-34332