Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais
Summary
A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.
Abstract
A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.
Introduction
O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita 5,6. A formação óssea nesses materiais de engenharia é geralmente obtida usando o material mineralizado como material de priming para permitir que as células-tronco se diferenciem diretamente em osteoblastos através do processo de ossificação intramembrana (IMO)7. Esse processo carece do passo angiogênico, resultando em vascularização insuficiente in vivo do enxerto após o implante8,9,10 e, portanto, abordagens utilizando esse processo podem não ser ideais para o tratamento de grandes defeitos ósseos11.
Estratégias aplicadas para recapitular o processo de ossificação endocondral (ECO), um mecanismo inato na esquelética durante o desenvolvimento, têm demonstrado superar problemas significativos associados às abordagens tradicionais baseadas na IMO. Na ECO, os condrócitos do molde cartilaginoso liberam fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove infiltração vascular e remodelamento do molde cartilaginoso emosso12. A abordagem ECO-mediada para osteogênese via remodelamento cartilaginoso e angiogênese, que também é ativada durante o reparo de fraturas, usa tecido cartilaginoso criado artificialmente derivado de CTMs como material de priming. Os condrócitos podem tolerar hipóxia em defeitos ósseos, induzir angiogênese e converter um enxerto de cartilagem livre de vasculares em tecido angiogênico. Numerosos estudos têm relatado que enxertos de cartilagem à base de CTM geram osso in vivo com a implementação de tal programa ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Um requisito essencial para a aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é como preparar a quantidade desejada de enxerto de cartilagem em um ambiente clínico. Preparar cartilagem clínica de um tamanho que se adapte ao defeito ósseo real não é prático. Portanto, a cartilagem do enxerto deve formar osso integralmente quando múltiplos fragmentos são implantados22. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos manipulados por tecidos para ossificação endocondral. Muitos hidrogéis de origem natural suportam a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; no entanto, o material de suporte ideal para atender aos requisitos de aplicação clínica permaneceu indeterminado. O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível presente na matriz extracelular da cartilagem33. O AH interage com as CTMs via receptores de superfície, como o CD44, para auxiliar a diferenciação condrogênica 25,26,28,30,31,32,34. Além disso, os scaffolds de AH promovem diferenciação osteogênica mediada pela IMO de células-tronco da polpa dentária humana35, e scaffolds combinados com colágeno promovem osteogênese mediada por ECO36,37.
Aqui, apresentamos um método para o preparo de hidrogéis de AH utilizando CTMs humanas adultas derivadas da medula óssea e seu uso para condrogênese hipertrófica in vitro e posterior ossificação endocondral in vivo38. Comparamos as características do AH com as do colágeno, um material amplamente aplicado na engenharia do tecido ósseo com CTMs e um material útil para a ampliação de enxertos artificiais para ossificação endocondral17. Em um modelo de camundongo imunocomprometido, construções de AH e colágeno semeadas com CTMs humanas foram avaliadas quanto ao potencial ECO in vivo por implante subcutâneo. Os resultados mostram que os hidrogéis de AH são excelentes como arcabouço para CTMs criarem enxertos de cartilagem artificial que permitem a formação óssea através de ECO.
O protocolo é dividido em duas etapas. Primeiro, construções de CTMs humanas semeadas com hidrogel de hialuronano são preparadas e diferenciadas em cartilagem hipertrófica in vitro. Em seguida, os construtos diferenciados são implantados subcutaneamente em um modelo nude para induzir a ossificação endocondral in vivo (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo38. Al?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 e 22K10032 ao MAI).
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
| Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
| Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
| basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
| bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
| dexamethasone | Merck | D8893 | |
| Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
| Dormicum | Astellas Pharma | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
| Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
| Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
| HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
| IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
| ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
| L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
| L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
| L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
| MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
| paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
| PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
| TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
| Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
| Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
| β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |
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