Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.
Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) kullanılarak yapılan konvansiyonel kemik rejenerasyon tedavisinin, anjiyogenezi indükleyecek bir mekanizmaya sahip olmadığı için kritik boyuttan daha büyük kemik defektlerine uygulanması zordur. MSC’lerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesi, endokondral ossifikasyon (ECO) yoluyla in vivo anjiyogenez ve kemik oluşumunu indükler. Bu nedenle, bu EKO aracılı yaklaşım gelecekte umut verici bir kemik rejenerasyon tedavisi olabilir. Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulamasının önemli bir yönü, kemik defektini onarmak için implante edilecek yeterli kıkırdağın hazırlanması için bir protokol oluşturmaktır. Gerçek kemik defektinin şekline uyan boyutta tek bir greftli kıkırdak kütlesi tasarlamak özellikle pratik değildir. Bu nedenle, nakledilecek kıkırdak, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturma özelliğine sahip olmalıdır. Hidrojeller, klinik gereksinimleri karşılamak için endokondral kemikleşme için doku mühendisliği greftlerini büyütmek için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro olarak MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo olarak ECO’yu desteklese de, klinik uygulamaların ihtiyaçlarını karşılamak için en uygun iskele malzemesi henüz belirlenmemiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak hücre dışı matrisinin çok önemli bir bileşenidir ve biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. Burada, HA hidrojellerinin, MSC bazlı kıkırdak dokusunun in vitro farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel özelliklere sahip olduğunu gösteriyoruz.
Otolog kemik, travma, konjenital defektler ve cerrahi rezeksiyona bağlı kemik defektlerinin onarımında hala altın standarttır. Bununla birlikte, otojen kemik greftinin donör ağrısı, enfeksiyon riski ve hastalardan izole edilebilecek sınırlı kemik hacmi gibi önemli sınırlamaları vardır 1,2,3,4. Doğal veya sentetik polimerleri kalsiyum fosfat veya hidroksiapatit 5,6 gibi mineralize malzemelerle birleştiren kemik ikameleri olarak çok sayıda biyomalzeme geliştirilmiştir. Bu mühendislik malzemelerinde kemik oluşumu, kök hücrelerin zar içi kemikleşme (IMO) işlemi yoluyla doğrudan osteoblastlara farklılaşmasına izin vermek için genellikle mineralize malzeme bir astar malzemesi olarak kullanılarak elde edilir7. Bu işlem anjiyojenik adımdan yoksundur, bu da implantasyondan sonra greftin yetersiz in vivo vaskülarizasyonuna neden olur 8,9,10 ve bu nedenle, böyle bir işlemi kullanan yaklaşımlar büyük kemik kusurlarını tedavi etmek için optimal olmayabilir 11.
Gelişim sırasında iskeletogenezde doğuştan gelen bir mekanizma olan endokondral ossifikasyon (ECO) sürecini özetlemek için uygulanan stratejilerin, geleneksel IMO tabanlı yaklaşımlarla ilişkili önemli sorunların üstesinden geldiği gösterilmiştir. EKO’da, kıkırdak şablonundaki kondrositler, vasküler infiltrasyonu ve kıkırdak şablonunun kemiğe yeniden şekillenmesini destekleyen vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) serbest bırakır12. Kırık onarımı sırasında da aktive olan kıkırdak yeniden şekillenmesi ve anjiyogenez yoluyla osteogeneze ECO aracılı yaklaşım, MSC’lerden türetilen yapay olarak oluşturulmuş kıkırdak dokusunu bir astar materyali olarak kullanır. Kondrositler kemik defektlerinde hipoksiyi tolere edebilir, anjiyogenezi indükleyebilir ve vasküler serbest kıkırdak greftini anjiyojenik dokuya dönüştürebilir. Çok sayıda çalışma, MSC bazlı kıkırdak greftlerinin böyle bir ECO programı uygulayarak in vivo kemik ürettiğini bildirmiştir 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Bu EKO aracılı yaklaşımın klinik uygulaması için temel bir gereklilik, klinik ortamda istenen miktarda kıkırdak greftinin nasıl hazırlanacağıdır. Gerçek kemik defektine uyan boyutta klinik kıkırdak hazırlamak pratik değildir. Bu nedenle, greft kıkırdağı, birden fazla parça implante edildiğinde bütünleşik olarak kemik oluşturmalıdır22. Hidrojeller, endokondral kemikleşme için doku mühendisliği yapılmış greftlerin ölçeklendirilmesi için çekici bir araç olabilir. Doğal olarak türetilen birçok hidrojel, in vitro MSC kıkırdak oluşumunu ve in vivo ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Bununla birlikte, klinik uygulama gereksinimlerini karşılamak için en uygun destek materyali belirlenememiştir. Hyaluronik asit (HA), kıkırdak33’ün hücre dışı matrisinde bulunan biyolojik olarak parçalanabilen ve biyouyumlu bir polisakkarittir. HA, kondrojenik farklılaşmayı desteklemek için CD44 gibi yüzey reseptörleri aracılığıyla MSC’lerle etkileşime girer 25,26,28,30,31,32,34. Ek olarak, HA iskeleleri, insan diş pulpası kök hücrelerinin35 IMO aracılı osteojenik farklılaşmasını teşvik eder ve kollajen ile birleştirilen iskeleler, ECO aracılı osteogenezi36,37 destekler.
Burada, kemik iliğinden türetilmiş yetişkin insan MSC’leri kullanılarak HA hidrojellerinin hazırlanması ve bunların in vitro hipertrofik kondrogenez ve ardından endokondral ossifikasyon için kullanımı için bir yöntem sunuyoruz in vivo38. HA’nın özelliklerini, kemik dokusu mühendisliğinde MSC’lerle yaygın olarak uygulanan bir malzeme olan ve endokondral ossifikasyon için yapay greftlerin ölçeklendirilmesi için yararlı bir malzeme olan kollajen ile karşılaştırdık17. İmmün sistemi baskılanmış bir fare modelinde, insan MSC’leri ile tohumlanan HA ve kollajen yapıları, deri altı implantasyon ile in vivo ECO potansiyeli açısından değerlendirildi. Sonuçlar, HA hidrojellerinin, MSC’lerin ECO yoluyla kemik oluşumuna izin veren yapay kıkırdak greftleri oluşturması için bir iskele olarak mükemmel olduğunu göstermektedir.
Protokol iki adıma ayrılmıştır. İlk olarak, hyaluronan hidrojel üzerine tohumlanan insan MSC’lerinin yapıları hazırlanır ve in vitro olarak hipertrofik kıkırdağa farklılaştırılır. Daha sonra, farklılaşmış yapılar, in vivo endokondral ossifikasyonu indüklemek için çıplak bir modelde deri altına implante edilir (Şekil 1).
Hipertrofik kıkırdaktan kemiğe geçişi destekleyen uygun iskele materyallerinin kullanılması, MSC bazlı tasarlanmış hipertrofik kıkırdak greftlerini büyütmek ve klinik olarak anlamlı boyuttaki kemik kusurlarını tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, HA’nın in vitro olarak MSC bazlı hipertrofik kıkırdak dokusunun farklılaşmasını desteklemek ve in vivo endokondral kemik oluşumunu teşvik etmek için mükemmel bir iskele materyali olduğunu gösteriyoruz <sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği’nden (JSPS) Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (KAKENHI) ile desteklenmiştir. JP19K10259 ve 22K10032’den MAI’ye).
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 209-16941 | |
Antisedan | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
ascorbate-2-phosphate | Nacalai Tesque | 13571-14 | |
Bambanker | GC Lymphotec | CS-02-001 | |
basic fibroblastic growth factor | Reprocell | RCHEOT002 | |
bovine serum albumin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 012-23881 | 7.5 w/v% |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10283 | |
dexamethasone | Merck | D8893 | |
Domitor | Nippon Zenyaku Kogyo | ||
Dormicum | Astellas Pharma | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Merck | D6429 | high glucose |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Merck | D6421 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
Gentamicin sulfate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 1676045 | 10 mg/mL |
Haccpper Generator | TechnoMax | CH-400-5QB | 50 ppm hypochlorous acid water |
Human Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-2501 | |
HyStem Cell Culture Scaffold Kit | Merck | HYS020 | |
IL-1ß | PeproTech | AF-200-01B | |
ITS-G supplement | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 090-06741 | ×100 |
L-Alanyl-L-Glutamine | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 016-21841 | 200mmol/L (×100) |
L-proline | Nacalai Tesque | 29001-42 | |
L-Thyroxine | Merck | T1775 | |
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit |
Lonza | PT-3001 | |
paraffin | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 165-13375 | |
PBS / pH7.4 100ml | Medicago | 09-2051-100 | |
TGF-β3 | Proteintech | HZ-1090 | |
Vetorphale | Meiji Seika Kaisha | ||
Visiocare Ointment | SAVAVET/SAVA Healthcare | ||
β-glycerophosphate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 048-34332 |