Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.
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Article de méthode
Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de la peau aviaire au cours de l’embryogenèse est un modèle unique qui peut fournir des informations précieuses sur la structure des tissus. Ici, trois variations sur les cultures d’explants de peau pour examiner différents aspects du développement de la peau sont décrites. Tout d’abord, les cultures et les manipulations d’organes ex vivo offrent aux chercheurs la possibilité d’observer et d’étudier directement le développement des bourgeons de plumes. La culture d’explants de peau peut croître pendant 7 jours, ce qui permet une analyse directe du comportement cellulaire et l’imagerie 4D à intervalles réguliers pendant cette période de croissance. Cela permet également des manipulations physiques et moléculaires des conditions de culture pour visualiser la réponse tissulaire. Par exemple, des billes enrobées de facteur de croissance peuvent être appliquées localement pour induire des changements dans le motif des plumes dans une zone limitée. Alternativement, la transduction virale peut être administrée à l’échelle mondiale dans les milieux de culture pour réguler à la hausse ou à la baisse l’expression des gènes. Deuxièmement, le protocole de recombinaison cutanée permet aux chercheurs d’étudier les interactions tissulaires entre l’épiderme et le mésenchyme qui proviennent de différentes régions de la peau, de différents stades de vie ou de différentes espèces. Cela offre l’occasion de tester la fenêtre temporelle dans laquelle l’épithélium est capable de répondre aux signaux et sa capacité à former différents appendices cutanés en réponse à des signaux provenant de différentes sources mésenchymateuses. Troisièmement, la reconstitution de la peau à l’aide de cellules dermiques dissociées recouvertes d’un épithélium intact réinitialise le développement de la peau et permet d’étudier les processus initiaux de structuration périodique. Cette approche améliore également notre capacité à manipuler l’expression des gènes entre les cellules dissociées avant de créer l’explant de peau reconstituée. Cet article présente les trois protocoles de culture et des expériences exemplaires pour démontrer leur utilité.
Introduction
Le développement de la peau de l’embryon aviaire est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de la morphogenèse en raison des motifs distincts et de l’accessibilité à la microchirurgie et à la manipulation 1,2. Cependant, l’évaluation des événements cellulaires et moléculaires dans les tissus intacts peut être difficile car la présence de tissus étrangers peut compliquer les observations microscopiques. De plus, la capacité de manipuler l’expression des gènes pour tester leur rôle dans la morphogenèse de la peau n’est pas toujours une tâche simple. Nous constatons que nous pouvons tester les fonctions ....
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Protocole
1. Culture d’explants de peau de poulet (Figure 1)
- Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et les étaler selon Hamburger et Hamilton14.
- Au stade 28 (~E5.5), le deuxième doigt et le troisième orteil du membre sont plus longs que les autres ; Trois doigts et quatre orteils sont distincts.
- Au stade 29 (~E6), l’aile est pliée au niveau du coude ; Le deuxième doigt est nettement plus long que les autres.
- Au stade 30 (~E6.5), deux rangées de bourgeons plumaux dorsaux de chaque côté de la moelle épiniè....
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Résultats
Cultures d’explants de peau
Le développement des bourgeons de plumes à partir de cultures d’organes cutanés ex vivo peut être observé directement au microscope. À l’aide du modèle de culture d’explants de peau de poulet de stade 30, les placodes sont visibles le long de la ligne médiane. Le front morphogénétique se propage ensuite progressivement latéralement vers la périphérie de la peau avec la formation de nouvelles primordiums de plumes. Ces primordia à plumes se transformeront en petits .......
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Discussion
La recombinaison tissulaire permet d’explorer les contributions uniques de l’épithélium et du mésenchyme. Chez les poulets, les plumes commencent à se développer au jour embryonnaire 7 (E7) tandis que les écailles commencent à E9. Lorsque le mésenchyme de l’écaille E9 est recombiné avec l’épithélium de la plume E7, le tissu recombiné forme des écailles, et lorsque le mésenchyme de la plume E7 est recombiné avec l’épithélium de l’écaille E9, les plumes se forment11. Ces études ont démontré que le m.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail est soutenu par les subventions R37 AR 060306, R01 AR 047364 et RO1 AR078050 du NIAMS. Le travail est également soutenu par un contrat de recherche collaboratif entre l’USC et l’Université médicale de Chine à Taïwan. Nous remercions la classe USC BISC 480 Developmental Biology 2023 d’avoir testé avec succès ce protocole de culture de peau aviaire au cours de plusieurs modules de laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plat de culture à 6 puits ; | Falcon | REF 353502 | Cultures d’interface air-liquide (ALI) |
| Encart de culture cellulaire ; | Faucon | REF 353090. | 0,4 et micro ; m Membrane PET transparente |
| Collagénase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco' Eagle modifié' s medium ; | Corning | 10-013-CV | 4,5 g/L de glucose |
| Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sérum fœtal bovin | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks' s solution saline tamponnée | Gibco | 14170-112 | Sans calcium, sans magnésium |
| Pénicilline/streptomycine ; | Gibco | 15-140-122 | |
| Phosphate de pogassium monobasique (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Chlorure de sodium (Nacl) | EMD ; | CAS 7647-14-5 | |
| Phosphate de sodium monobasique (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsine | Gibco | 27250-042 |
Références
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux,
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Réimpressions et autorisations
