清醒小鼠的高血糖钳夹和低血糖钳夹

Summary

高血糖钳夹用于测量胰岛素释放，并维持较高的血糖浓度。降糖钳夹用于测量由反调节反应引起的葡萄糖产生。两种方法都使用相同的外科手术。在这里，我们提出了一种钳夹技术来评估全身葡萄糖代谢。

Abstract

糖尿病 （DM） 是由胰腺β细胞释放的胰岛素不足 （Type1 DM） 和肌肉、肝脏和脂肪组织中的胰岛素敏感性 （Type2 DM） 引起的。胰岛素注射治疗糖尿病患者，但会导致低血糖作为副作用。皮质醇和儿茶酚胺被释放以激活肝脏产生的葡萄糖以恢复低血糖，称为反调节反应 （CRR）。在使用啮齿动物模型的 DM 研究中，葡萄糖耐量试验和 2-脱氧葡萄糖注射液分别用于测量胰岛素释放和 CRR。然而，在实验过程中，血糖浓度持续变化，导致评估净胰岛素释放量和 CRR 的困难。本文描述了一种将清醒小鼠的血糖保持在 250 mg/dL 或 50 mg/dL 的方法，以分别比较胰岛素和 CRR 激素的释放。

将聚乙烯管植入小鼠的颈动脉和颈静脉，让小鼠从手术中恢复。颈静脉管通过注射泵连接到汉密尔顿注射器，以恒定和可变的速率输注胰岛素或葡萄糖。颈动脉管用于采血。对于高血糖钳夹，将 30% 的葡萄糖注入静脉，每 5 分钟或 10 分钟从动脉血中测量血糖水平。增加 30% 葡萄糖的输注速率，直到血糖水平变为 250 mg/dL。收集血液以测量胰岛素浓度。对于低血糖钳夹，将 10 mU/kg/min 胰岛素与 30% 葡萄糖一起输注，其输注速率可变以维持 50 mg/dL 的血糖水平。当葡萄糖输注和血糖都达到稳定状态时，收集血液以测量反调节激素。高血糖钳和低血糖钳具有相同的外科手术和实验设置。因此，该方法对全身葡萄糖代谢的研究人员很有用。

Introduction

葡萄糖是细胞的重要能量来源，缺乏葡萄糖会导致各种症状和并发症。在低血糖（低血糖，空腹血糖水平通常低于 70 mg/dL，但不应由单一值¹ 确定）的情况下，最常见的症状包括虚弱、意识模糊、出汗和头痛。它还可能破坏大脑功能，增加心血管事件和死亡的风险²。相反，高血糖症是一种血浆葡萄糖浓度超过正常水平（空腹血糖^{水平 3} 通常> 126 mg/dL）的疾病。这可能发生在胰岛素产生或利用不足的糖尿病患者身上。高血糖症可导致糖尿病酮症酸中毒，当身体不能使用葡萄糖作为能量，而是分解脂肪酸作为燃料时，就会发生这种情况。高血糖高渗状态也会增加死亡率⁴.长期高血糖会对血管、神经和器官造成损害，导致心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病等多种慢性并发症的发展。因此，血糖浓度必须保持在 100 mg/dL 和 120 mg/dL 之间的严格范围内。

在单室模型中，血糖由葡萄糖输入和输出之间的平衡调节（图1A）。葡萄糖输入包括从食物中吸收的葡萄糖和从肝脏、肾脏和小肠产生的葡萄糖。葡萄糖输出包括组织中的葡萄糖摄取和肾脏的葡萄糖处理。葡萄糖输入量和输出量均受内分泌激素调节。例如，胰高血糖素、皮质酮和儿茶酚胺（称为反调节激素）在血糖水平降低时释放⁵.它们刺激糖原的分解和葡萄糖的合成，主要来自肝脏;这些过程分别称为糖原分解和糖异生。高血糖会增加胰腺β细胞释放的胰岛素，并刺激肌肉、脂肪组织和心脏的葡萄糖摄取 6,7,8,9。运动可增加胰岛素依赖性葡萄糖的摄取¹⁰.交感神经系统增加肌肉和棕色脂肪组织中的葡萄糖摄取 ^6,11。为了测量调节外周组织中葡萄糖代谢的能力，研究人员通常使用葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）（图1B，C）。在GTT中，必须考虑两个因素：胰岛素释放和胰岛素敏感性（图1B）。然而，每只小鼠在120分钟测试期间的葡萄糖浓度曲线不同，这可能会影响不同量的激素释放。在ITT中，血糖受胰岛素敏感性和反调节激素释放的调节。因此，在血糖水平不恒定的情况下，很难确定 GTT 和 ITT 中葡萄糖代谢、胰岛素释放和胰岛素敏感性的确切含义。

为了克服这些问题，希望将血糖保持在恒定水平（或“钳制”）。在高血糖钳夹中，葡萄糖被注入血液中，将血糖水平提高到特定水平，然后维持在该水平一段时间。每 5-10 分钟根据血糖水平的测量值调整输注葡萄糖的量，以保持稳定状态。该技术对于了解钳制葡萄糖水平下胰岛素分泌的参数特别有用。降糖钳夹是一种通过输注胰岛素来维持低血糖水平的方法。葡萄糖以可变速率输注以维持特定的血糖水平。如果小鼠无法从低血糖中恢复，则应输注更多的葡萄糖。

尽管进行高血糖和低血糖钳夹有很多优点，但手术和实验程序在技术上被认为是困难的。因此，很少有研究小组能够做到这一点。我们旨在为有财务和劳动力限制的研究人员描述这些方法，以较低的预算开始这些实验。

Protocol

所有程序均由熊本大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。 注意：为了缓解疼痛，布洛芬在饮用水（0.11mg / mL）中给予48小时，并在手术前30分钟给予丁丙诺啡（0.05-0.1mg / kg ip）。无菌条件包括手套、口罩和在动物之间用环氧乙烷灭菌的高压灭菌器械。手术在设置为37°C的加热垫上进行，并为每只动物覆盖一个新的实验室垫。手术前，用甜菜碱溶液和酒精清洁手术区域?…

Representative Results

在实验开始时禁食3小时的雄性C57BL / 6N小鼠（8周龄，超过25g BW）中进行低血糖钳研究（图4A，B）。初始血糖水平为 136 mg/dL （t = -15 min）。如果低于 90 mg/dL，可能是因为手术不顺利，或者动脉导管插入太深，或者血凝块进入血流。手术后的小鼠状况会影响小鼠的能量代谢。在健康状况不佳的情况下，无法测量生理葡萄糖代谢。C57BL术后更容易凝血;体重较高的小鼠?…

Discussion

这里描述的方法很简单，可以使用移液器吸头、注射器和普通实验室中的其他物品来完成。尽管研究人员可能需要购买额外的管子和泵，但不需要昂贵的设备。因此，与以前的报告相比，这种导管插入术和钳夹术方案更容易开始12,13,14。

钳夹技术是在 1970 年左右开发的，已用于小鼠和人类^15</s…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5