Hyperglykemisk klemme og hypoglykemisk klemme i bevisste mus

Summary

En hyperglykemisk klemme brukes til å måle insulinfrigjøring med en opprettholdt høyere blodsukkerkonsentrasjon. En hypoglykemisk klemme er for måling av glukoseproduksjon indusert av motregulerende responser. Begge metodene bruker samme kirurgiske prosedyre. Her presenterer vi en klemmeteknikk for å vurdere systemisk glukosemetabolisme.

Abstract

Diabetes mellitus (DM) skyldes utilstrekkelig insulinfrigjøring fra bukspyttkjertelen β-celler (Type 1 DM) og insulinfølsomhet i muskler, lever og fettvev (Type 2 DM). Insulininjeksjon behandler DM-pasienter, men fører til hypoglykemi som bivirkning. Kortisol og katekolaminer frigjøres for å aktivere glukoseproduksjon fra leveren for å gjenopprette hypoglykemi, kalt motregulerende responser (CRR). I DM-forskning ved hjelp av gnagermodeller brukes glukosetoleransetester og 2-deoksyglukoseinjeksjon til å måle henholdsvis insulinfrigivelse og CRR. Imidlertid endres blodsukkerkonsentrasjonen vedvarende under eksperimenter, noe som forårsaker vanskeligheter med å vurdere netto insulinfrigjøring og CRR. Denne artikkelen beskriver en metode der blodsukkeret holdes på 250 mg / dL eller 50 mg / dL i bevisste mus for å sammenligne frigivelsen av insulin og CRR-hormoner, henholdsvis.

Polyetylenrør er implantert i musens halspulsåre og halsvenen, og musene får lov til å komme seg fra operasjonen. Jugularveneren er koblet til en Hamilton-sprøyte med en sprøytepumpe for å muliggjøre insulin- eller glukoseinfusjon med konstant og variabel hastighet. Den halspulsåren slangen er for blod samling. For den hyperglykemiske klemmen tilføres 30% glukose i venen, og blodsukkernivået måles fra arterielt blod hvert 5. minutt eller 10. minutt. Infusjonshastigheten på 30 % glukose økes til blodglukosenivået blir 250 mg/dl. Blod samles for å måle insulinkonsentrasjoner. Ved hypoglykemisk klemme infunderes 10 mE/kg/min insulin sammen med 30 % glukose, hvis infusjonshastighet er variabel for å opprettholde 50 mg/dl blodglukosenivå. Blod samles for å måle motregulerende hormoner når både glukoseinfusjon og blodsukker når en jevn tilstand. Både hyperglykemiske og hypoglykemiske klemmer har samme kirurgiske prosedyre og eksperimentelle oppsett. Dermed er denne metoden nyttig for forskere av systemisk glukosemetabolisme.

Introduction

Glukose er en viktig energikilde for celler, og mangel på glukose kan føre til en rekke symptomer og komplikasjoner. I tilfelle av lav glukose (hypoglykemi, vanligvis mindre enn 70 mg / dL i fastende blodsukkernivå, men bør ikke bestemmes av en enkelt verdi¹), er de vanligste symptomene svakhet, forvirring, svette og hodepine. Det kan også forstyrre hjernefunksjonen og øke risikoen for kardiovaskulære hendelser og dødelighet². Omvendt er hyperglykemi en medisinsk tilstand der plasmaglukosekonsentrasjonen overstiger normale nivåer (vanligvis > 126 mg / dL i fastende blodsukkernivå³). Dette kan forekomme hos personer med diabetes som enten har et underskudd i insulinproduksjon eller utnyttelse. Hyperglykemi kan føre til diabetisk ketoacidose, som oppstår når kroppen ikke kan bruke glukose til energi, men i stedet bryter ned fettsyrer for drivstoff. Den hyperglykemiske hyperosmolare tilstanden øker også dødeligheten⁴. Langvarig hyperglykemi kan forårsake skade på blodkar, nerver og organer, noe som fører til utvikling av flere kroniske komplikasjoner som kardiovaskulær sykdom, retinopatier og nyresykdommer. Dermed må blodsukkerkonsentrasjonen opprettholdes i et tett område mellom 100 mg / dL og 120 mg / dL.

Blodsukker reguleres av balansen mellom glukoseinngang og -effekt i en ettromsmodell (figur 1A). Glukoseinngang inkluderer absorbert glukose fra mat og glukoseproduksjon fra lever, nyrer og tynntarm. Glukoseproduksjonen omfatter glukoseopptak i vev og glukoseavhending fra nyrene. Både mengden glukoseinngang og -utgang reguleres av endokrine hormoner. For eksempel frigjøres glukagon, kortikosteron og katekolaminer, kjent som motregulerende hormoner, når blodsukkernivået reduseres⁵. De stimulerer nedbrytningen av glykogen og syntesen av glukose, hovedsakelig fra leveren; Disse prosessene er kjent som henholdsvis glykogenolyse og glukoneogenese. Hyperglykemi øker insulinfrigjøringen fra bukspyttkjertelen β-celler og stimulerer glukoseopptak i muskler, fettvev og hjerte 6,7,8,9. Trening øker insulinuavhengig glukoseopptak¹⁰. Det sympatiske nervesystemet øker glukoseopptaket i muskler og brunt fettvev ^6,11. For å måle evnen til å regulere glukosemetabolismen i perifert vev, bruker forskere vanligvis glukosetoleransetesten (GTT) og insulintoleransetesten (ITT) (figur 1B, C). I GTT må to faktorer vurderes: insulinfrigjøring og insulinfølsomhet (figur 1B). Imidlertid er glukosekonsentrasjonskurven under 120 min test forskjellig i hver mus, noe som kan påvirke forskjellige mengder hormonfrigivelse. I ITT reguleres blodsukker av både insulinfølsomhet og frigjøring av motregulerende hormoner. Derfor er det vanskelig å bestemme den nøyaktige betydningen av glukosemetabolisme, insulinfrigjøring og insulinfølsomhet i GTT og ITT, i situasjoner der blodsukkernivået ikke er konstant.

For å overvinne disse problemene, er det ønskelig å holde blodsukkeret på et konstant nivå (eller “klemme”). I hyperglykemisk klemme blir glukose infundert i blodet for å øke blodsukkernivået til et bestemt nivå og deretter opprettholdt på det nivået i en periode. Mengden infundert glukose justeres basert på målinger av blodsukkernivået hvert 5-10 minutt for å opprettholde en jevn tilstand. Denne teknikken er spesielt nyttig for å forstå parametrene for insulinsekresjon ved et klemt glukosenivå. Hypoglykemisk klemme er en metode for å opprettholde lave blodsukkernivåer ved infusjon av insulin. Glukose tilføres med variabel hastighet for å opprettholde et spesifikt blodsukkernivå. Hvis musen ikke kan gjenopprette fra hypoglykemi, bør mer glukose infunderes.

Selv om det er mange fordeler med å utføre hyperglykemiske og hypoglykemiske klemmer, anses de kirurgiske og eksperimentelle prosedyrene som teknisk vanskelige. Dermed har få forskningsgrupper vært i stand til å gjøre dem. Vi hadde som mål å beskrive disse metodene for forskere med økonomiske og arbeidsstyrkebegrensninger for å starte disse eksperimentene på et lavere budsjett.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Kumamoto University. MERK: For smertelindring ble ibuprofen gitt i drikkevann (0,11 mg / ml) i 48 timer, og buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg i.p.) ble gitt 30 minutter før operasjonen. Sterile forhold inkluderer hansker, masker og autoklaverte instrumenter sterilisert med etylenoksid mellom dyr. Operasjonen ble utført på en varmepute satt til 37 °C og dekket av en ny laboratoriematte for hvert dyr. Før op…

Representative Results

Den hypoglykemiske klemmestudien ble utført på hannmus C57BL/6N (8 uker gamle, mer enn 25 g kroppsvekt) 3 timer fastende ved starten av forsøket (figur 4A,B). Det opprinnelige blodsukkernivået var 136 mg/dl (t = -15 min). Hvis det er mindre enn 90 mg / dL, kan det enten være fordi operasjonen ikke gikk bra, eller arterielle kateteret ble satt inn for dypt, eller blodpropper har kommet inn i blodstrømmen. Musetilstanden etter operasjonen påvirker energimetabolismen i m…

Discussion

Metoden beskrevet her er enkel og kan gjøres med pipettespisser, sprøyter og andre gjenstander som finnes i vanlige laboratorier. Selv om forskere kanskje trenger å kjøpe ekstra rør og pumper, er dyrt utstyr ikke nødvendig. Dermed er denne protokollen for kateterisering og klemme lettere å starte sammenlignet med tidligere rapporter 12,13,14.

Klemmeteknikken ble utviklet rundt 1970 og har blitt…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5