İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli
Summary
Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC’li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.
Abstract
Nekrotizan enterokolit (NEK), tam olarak anlaşılamamış, karmaşık patogenezi nedeniyle araştırılması zor olan ciddi ve potansiyel olarak ölümcül bir bağırsak hastalığıdır. NEC’in patofizyolojisi, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulmasını, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliğini, epitel hücre ölümünü, mikrobiyal disbiyozisis ve düzensiz inflamasyonu içerir. NEC’yi incelemek için kullanılan geleneksel araçlar arasında hayvan modelleri, hücre dizileri ve insan veya fare bağırsak organoidleri bulunur. Bu model sistemlerini kullanan çalışmalar, alanın hastalık patofizyolojisi anlayışını geliştirmiş olsa da, insan NEC’nin karmaşıklığını özetleme yetenekleri sınırlıdır. NEC-on-a-chip adı verilen mikroakışkan teknolojisini kullanan geliştirilmiş bir in vitro NEC modeli geliştirilmiştir. Çip üzerinde NEC modeli, preterm bir yenidoğandan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış, insan endotel hücreleri ve şiddetli NEC’li bir bebekten alınan mikrobiyom ile birlikte kültürlenmiş bir mikroakışkan cihazdan oluşur. Bu model, NEC’nin patofizyolojisine yönelik mekanik çalışmalar için değerli bir araçtır ve yenidoğan bağırsak hastalıkları için ilaç keşif testi için yeni bir kaynaktır. Bu yazıda, NEC-on-a-chip modelinin ayrıntılı bir açıklaması sağlanacaktır.
Introduction
Nekrotizan enterokolit (NEC), 1500 g'< doğanlarda %10'a varan insidansla erken doğmuş bebekleri etkiler1. NEC’in patofizyolojisi karmaşıktır ve bağırsak epitelinde hasar, bağırsak sıkı bağlantılarının bozulması, artmış bağırsak bariyeri geçirgenliği, immün düzensizlik ve epitel hücre ölümünü içerir 2,3. NEC’in patogenezinde rol oynayan mekanizmalar hakkındaki anlayışımız eksik kalmıştır ve onlarca yıllık araştırmalara rağmen hala etkili bir hedefe yönelik tedavi yoktur.
NEC araştırmalarını ilerletmenin önündeki önemli bir engel, insan bebeklerinden izole edilen birincil bağırsak dokusunun sınırlı mevcudiyeti ve küçük boyutudur. NEC’li bebeklerden rezeke edilen bağırsak dokusu genellikle nekrotiktir ve ciddi şekilde hasar görür, bu da hastalık başlangıcından önce gelen mekanizmalara yönelik çalışmaları zorlaştırır. Örneğin, NEC’li bebeklerin ince bağırsağı bağışıklık hücreleri ile doludur ve bağırsak kök hücre sayısında azalma, epitel hücre proliferasyonunda azalma ve epitel hücresi apoptozunda artış da gözlenir 4,5,6,7. Bu, bu örneklerden bağırsak epitel hücrelerinin kültürlenmesinde ve bu düşmanca enflamatuar ortamda parçalanabilen RNA ve proteinlerin izole edilmesinde zorluklara yol açar. Ek olarak, cerrahi NEC’li bebeklerde hastalık süreci zaten ilerlemiş olduğundan, hastalığı indükleyen faktörlere yönelik mekanik çalışmalar mümkün değildir. Bu sınırlamalar, NEC’nin mekanik çalışmaları için hayvan modellerine güvenilmesine yol açmıştır.
Fareler, sıçanlar, domuz yavruları, tavşanlar ve babunlar için NEC’nin hayvan modelleri oluşturulmuştur 5,8,9,11. Hayvan modellerinin güçlü bir gücü, NEC benzeri bağırsak hastalığının, disbiyotik bir mikrobiyom, tekrarlanan hipoksi atakları ve anne sütü beslemelerinin olmamasıdahil olmak üzere insanlarda NEC başlangıcı ile ilişkili faktörler tarafından indüklenmesidir 5,8,10,11. Ek olarak, deneysel NEC sırasında gözlenen inflamatuar yanıt ve patolojik değişiklikler paralel insan hastalığı 5,9,12. Bu modeller insan NEC’nin birçok özelliğini taklit ederken, hayvanlarda ve insanlarda NEC’nin patofizyolojisi arasında doğal farklılıklar vardır. Örneğin, NEC’in murin modeli, tam süreli doğan farelerde indüklenir ve bağırsak gelişimleri tamamlanmamış olsa da, NEC’in patofizyolojisi bu klinik bağlamda doğal olarak farklıdır. Doğumda murin bağırsak gen ekspresyonu, yaşayabilir bir insan fetüsüne benzer ve 14. güne kadar 22-24 haftalık bir preterm yenidoğanınkine yaklaşmaz (P14)13. Bu, murin NEC modelini karıştırır, çünkü bağırsak yaralanması genellikle P10’dan sonra farelerde indüklenemez. Ek olarak, kendi içinde yetiştirilmiş fare suşları, insan yenidoğanların15 immünolojik14 ve mikrobiyolojik çeşitliliğinden yoksundur, bu da başka bir kafa karıştırıcı faktör olarak hizmet eder. Bu nedenle, birincil insan örneklerinin NEC araştırmalarına daha fazla dahil edilmesi, bu alandaki çalışmaların klinik uygunluğunu artırmaktadır.
NEC mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar in vitro geleneksel olarak kolorektal adenokarsinom (Caco2) ve insan kolon adenokarsinomu (HT-29) hücreleri gibi yetişkin bağırsak kanseri hücrelerinden türetilen monotipik hücre dizilerini kullanmıştır16. Bu modeller, yetişkin kanser hücrelerinden büyümeleri, polarize olmayan mimarileri ve kültürde tekrarlanan geçişlerle ilgili fenotipik değişiklikler nedeniyle uygundur ancak fizyolojik önemi sınırlıdır. Bağırsak enteroidleri, bağırsak dokusunun kriptlerinden büyütülebildikleri, tüm bağırsak epitel alt tiplerine farklılaşabildikleri ve üç boyutlu (3D) villus benzeri bir yapıoluşturdukları için bu modelleri geliştirir 17,18,19,20. Son zamanlarda, bağırsak enteroidleri, çip üzerinde ince bir bağırsak modeli geliştirmek ve fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro model sistemi sağlamak için mikroakışkan teknolojisi ile birleştirilmiştir21.
İlk çip üzerinde organ mikroakışkan cihazları 2000’li yılların başında tanıtıldı22,23,24. İlk çip üzerinde organ modeli, çip üzerinde insan solunumu yapan akciğer25’ti. Bunu bağırsak 21, karaciğer26, böbrekler27, kemik iliği 28, kan-beyin bariyeri29 ve kalp30 gibi çok sayıda tek organ modeli izledi. Bu çip üzerinde organ modelleri, akut radyasyon sendromu,31 kronik obstrüktif akciğer hastalığı,32 ve nörodejeneratif hastalıklar 33 dahil olmak üzere akut, kronik ve nadir hastalıkları incelemek için kullanılmıştır. Bu çipler üzerindeki hücrelerin polarize doğası ve gözenekli bir zarla ayrılmış iki hücresel bölmenin varlığı, perfüzyon, kimyasal konsantrasyon gradyanları ve bağışıklık hücresi kemotaksisi gibi karmaşık fizyolojik süreçlerin modellenmesine izin verir34,35. Bu mikroakışkan sistemler, insan hastalıklarının patofizyolojisini ve mekanizmalarını incelemek için yeni bir araç sağlar.
Çip üzerinde ince bağırsak modeli, Kasendra ve ark. 2018 yılında, enteroidlere farklılaşmış ve mikroakışkanbir cihazda kültürlenmiş pediatrik (10-14 yaş) ince bağırsak biyopsi örneklerini kullanan. Vasküler endotel hücreleri, sürekli ortam akışı ve gerilme/gevşeme de bu modele dahil edildi. Bağırsak epitelyal alt tip farklılaşması, 3D villus benzeri eksenlerin oluşumu, mukus üretimi ve ince bağırsak gen ekspresyon paternlerini gözlemlediler21. Bu mikroakışkan model, yenidoğan bağırsak enteroidlerini, endotel hücrelerini ve NEC36’lı bir yenidoğandan mikrobiyomu içeren NEC-on-a-chip sisteminin geliştirilmesiyle yenidoğan hastalığına uygulandı. Çip üzerinde NEC, enflamatuar gen ekspresyonu, özel epitel hücrelerinin kaybı ve azalmış bağırsak bariyeri fonksiyonu36 dahil olmak üzere insan NEC’nin kritik özelliklerinin çoğunu özetler. Bu nedenle, bu model, mekanik çalışmalar ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere NEC çalışmasında çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bu makalede, NEC-on-a-chip modelinin performansı için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çip üzerinde NEC sistemi, NEC’nin patofizyolojisini modellemek için kullanılabilecek güçlü ve yeni bir araçtır. Bu platform, sürekli luminal akış ve esneme ile bir ko-kültür sistemi dahil ederek önceki modellere göre in vivo bağırsak ortamına daha çok benzeyen karmaşık bir mikro ortam sağlar. Bu koşullar, olgun epitelyal alt tiplerden ve sıkı bağlantılardan oluşan oldukça polarize bir epitel ile kaplı 3D villus benzeri mimarinin gelişimini teşvik eder (Şe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) ve R01HD105301 (MG), Chan Zuckerberg Girişimi Hibesi 2022-316749 (MG), Thrasher Araştırma Fonu Erken Kariyer Ödülü (LCF), Chapel Hill’deki North Carolina Üniversitesi’ne bağışçıların cömert desteğiyle UNC Çocuk Gelişimi Erken Kariyer Araştırmacısı Hibesi (LCF) tarafından desteklenmiştir. ve Chapel Hill’deki Kuzey Carolina Üniversitesi Pediatri Bölümü.
Materials
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
| BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
| BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
| Chip Cradle | Emulate | N/A | |
| Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
| Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
| ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
| ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
| Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
| HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
| Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
| Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
| Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
| L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
| NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
| Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
| Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
| Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
| Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
| Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
| Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
| Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |
References
- Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
- Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
- Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
- Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
- Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
- Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
- Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
- Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
- Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
- Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
- Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
- Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
- Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
- Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
- Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
- Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
- Emulate. . Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).
- Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
- JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
