Método de inmovilización vertical para el análisis de microscopía time-lapse en cianobacterias filamentosas
Summary
Presentamos un método simple y accesible para la visualización de cianobacterias filamentosas en el plano XY. Se utilizó una matriz de agarosa de bajo punto de fusión, que permite la adquisición de imágenes de proteínas implicadas en la división, en orientación vertical. Por lo tanto, esta metodología se puede aplicar a cualquier organismo filamentoso y diferentes tipos de proteínas.
Abstract
Un evento principal en la división celular bacteriana es el proceso de septación, donde la proteína FtsZ es el elemento clave. FtsZ polimeriza formando una estructura en forma de anillo (anillo Z) en el centro de la célula que sirve como andamio para otras proteínas de división. La microscopía de súper resolución en modelos bacterianos Escherichia coli y Bacillus subtilis mostró que el anillo Z es discontinuo, mientras que los estudios de imágenes de células vivas demostraron que FtsZ se mueve a lo largo del anillo por un mecanismo conocido como cinta rodante. Para estudiar la dinámica de FtsZ in vivo, es necesaria una colocación especial de la celda en posición vertical para obtener imágenes de la estructura completa del anillo en el plano XY. En el caso de las imágenes de FtsZ en cianobacterias multicelulares, como Anabaena sp. PCC7120, mantener los filamentos en posición vertical es un desafío debido al tamaño de las células y la longitud de los filamentos. En este artículo, describimos un método que permite la inmovilización vertical de filamentos PCC 7120 de Anabaena sp. utilizando agarosa y jeringas de bajo punto de fusión, para registrar el anillo Z en un mutante que expresa una proteína de fusión FtsZ-sfGFP. Este método es una forma rápida y económica de registrar la dinámica de proteínas en el sitio de división utilizando microscopía confocal.
Introduction
La división celular bacteriana es el proceso en el que una célula madre genera dos células hijas, en la mayoría de los casos por el mecanismo conocido como fisión binaria. Uno de los primeros eventos en el proceso de septación es la localización de FtsZ en el centro de la celda1. Esta proteína, que es estructuralmente homóloga a la tubulina2, se conserva y distribuye ampliamente en la mayoría de las bacterias, y su polimerización genera una estructura contráctil conocida como anillo Z3. Este anillo sirve como andamio para otras proteínas de división y juntas forman una maquinaria molecular llamada divisoma. Varios estudios han demostrado que el anillo Z es altamente dinámico y que los protofilamentos FtsZ se mueven por cinta de correr 4,5,6. Para estudiar el anillo Z en experimentos de lapso de tiempo, es aconsejable registrar el sitio de división en el plano XY para una mejor resolución y un muestreo rápido. Para lograr esto, es necesario desarrollar métodos de inmovilización celular vertical que comúnmente incluyen la nanofabricación de trampas celulares de microagujeros y dispositivos microfluídicos complejos7.
Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos que se clasifican como gramnegativos por su morfología celular. Sin embargo, filogenéticamente están más cerca de las bacterias grampositivas8. Estos organismos tienen genes de división celular que son comunes dentro de las bacterias grampositivas y gramnegativas, pero su divisoma también contiene elementos únicos9. PCC 7120 (en adelante Anabaena sp.) es cianobacteria filamentosa con un plano de división y es un modelo para el estudio de la división celular en cianobacterias multicelulares. En esta cepa, ha sido posible determinar el posicionamiento de FtsZ en el centro de las células10. Sin embargo, no hay estudios que muestren la dinámica in vivo de FtsZ en este modelo. En nuestro laboratorio, mediante apareamiento triparental y recombinación homóloga, obtuvimos un mutante totalmente segregado de Anabaena sp. que expresa la proteína FtsZ fusionada con sfGFP, que sustituyó al gen ftsZ endógeno completo. Desarrollamos un método de inmovilización celular rápido y sencillo que favorece la orientación vertical de los filamentos de cepa mutantes para experimentos time-lapse para visualizar las proteínas de división en cianobacterias filamentosas. Este método no necesita dispositivos microfluídicos que pueden ser costosos y difíciles de desarrollar. Como ejemplo, utilizamos este protocolo para visualizar el anillo Z en el mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopía confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de la dinámica de las proteínas divisómicas es sin duda un desafío. Particularmente, en las cianobacterias filamentosas, uno de los desafíos es la visualización del anillo Z en el plano horizontal, para lo cual las células deben estar orientadas verticalmente. El método que describimos aquí permite el posicionamiento del anillo Z en el plano XY para realizar los diferentes análisis. Este es el primer método simple para cianobacterias filamentosas que permite la visualización completa del anillo Z. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a National Doctoral Scholarships (ANID 21211333; 21191389) por el financiamiento. Grant Fondecyt 1161232.
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Microscopía Avanzada UMA UC.
Materials
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | – | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | – | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | – | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
