अलगाव और लिम्बल आला कोशिकाओं की पहचान
Summary
यहां, हम मानव लिम्बल आला कोशिकाओं को अलग करने और पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
यहां हम लिम्बल आला कोशिकाओं (एलएनसी) के अलगाव और पहचान के लिए एक मानक प्रक्रिया की रिपोर्ट करते हैं। एक नेत्र बैंक से प्राप्त लिम्बस ऊतक का उपयोग एलएनसी अलगाव के लिए किया गया था। ऊतक सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत 12 टुकड़ों में विभाजित किया गया था और एलएनसी और लिम्बल उपकला पूर्वज कोशिकाओं के साथ सेल समूहों को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज ए का उपयोग करके सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए पचाया गया था। सेल समूहों को आगे एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पचाया गया और फिर 5% मैट्रिगेल के साथ लेपित प्लास्टिक की सतह पर संशोधित भ्रूण स्टेम सेल माध्यम (एमईएससीएम) में सुसंस्कृत किया गया। कोशिकाओं को 70% संगम पर पारित किया गया था, और एलएनसी की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस, वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके की गई थी। प्राथमिक एलएनसी को अलग किया गया और 12 से अधिक बार पारित किया गया। P4 से P6 तक LNCs की प्रसार गतिविधि सबसे अधिक थी। LNCs ने BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, और PDGFRβ) की तुलना में उच्च स्टेम सेल मार्कर व्यक्त किए। इसके अलावा, परिणामों से पता चला कि P4 LNCs ने समान रूप से VIM, CD90, CD105 और PDGFRβ व्यक्त किए, लेकिन पैन-सीके नहीं, जिसका उपयोग LNCs की पहचान के लिए मार्कर के रूप में किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि लगभग 95%, 97%, 92%, और 11% LNCs ने क्रमशः CD73, CD90, CD105 और SCF व्यक्त किए, जबकि वे BMMSCs में 68%, 99%, 20% और 3% थे। एलएनसी अलगाव और पहचान के लिए मानक प्रक्रिया एलएनसी के व्यापक उपयोग के लिए एक विश्वसनीय प्रयोगशाला आधार प्रदान कर सकती है।
Introduction
कॉर्नियल उपकला स्टेम सेल की कमी की घटना (CESD), भी अंग स्टेम सेल की कमी कहा जाता है (LSCD)1, और कॉर्नियल उपकला उत्थान (सीईएस) कॉर्नियल संक्रमण और चोट की वजह से अधिक से अधिक जरूरी होते जा रहे हैं. यदि ठीक से इलाज नहीं किया जाता है, तो सीईएसडी अंधापन का कारण बन सकता है जिसके लिए कॉर्नियल प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है। नतीजतन, सीईएस उत्थान अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है। सहायक कोशिकाओं का एक समूह है जिसे लिम्बल आला कोशिकाएं (एलएनसी) कहा जाता है जो सीईएस फ़ंक्शन के लिए आवश्यक सहायता प्रदान करते हैं। लिम्बल स्ट्रोमल स्टेम कोशिकाओं को पहले पोलिसेट्टी एट अल.2 द्वारा अलग किया गया था और ज़ी एट अल.3 द्वारा एलएनसी के रूप में पहचाना गया था जो लिम्बल एपिथेलियम सबजेसेंट और लिम्बस के स्ट्रोमा में स्थानीयकृत होते हैं। एलएनसी कॉर्नियल रिम के प्रमुख सहायक स्टेम सेल हैं और, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएमएससी) के कार्य के साथ, और कॉर्नियल उपकला कोशिकाओं और कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं आदि में विकसित होने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एलएनसी के स्टेम-सेल गुण बीएमएमएससी8 की तुलना में अधिक आदिम हैं, जो पहले से ही क्लिनिक में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एमएससी के बाद एलएनसी भी अगला व्यवहार्य विकल्प बन सकता है, खासकर सीईएसडी के इलाज के लिए। सीईएस के लिए महत्वपूर्ण सहायक कोशिकाओं के रूप में, एलएनसी भी लिम्बस की “आला” संरचना से प्राप्त स्टेम सेल हैं। एलएनसी परिपक्व कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं (एमसीईसी) को सीईएस9 में विभेदित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। हालांकि, एलएनसी पर अध्ययन अभी भी अपेक्षाकृत अपर्याप्त हैं, और एलएनसी की शब्दावली, अलगाव, शुद्धिकरण, पहचान और विशेषताओं पर कोई सहमति नहीं है। कुछ शोधकर्ताओं ने एलएनसी लिम्बल बायोप्सी-व्युत्पन्न स्ट्रोमल स्टेम सेल10, लिम्बल मेसेनकाइमल स्टेम सेल 11, लिम्बल फाइब्रोब्लास्ट स्टेम सेल 12, और लिम्बल मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल13 का नाम दिया है। चूंकि एलएनसी की विकास विशेषताओं का विस्तार से वर्णन नहीं किया गया है, और उनके आशाजनक वैज्ञानिक और नैदानिक अनुप्रयोगों के कारण, और भविष्य में सबसे महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरणों में से एक हो सकता है, एलएनसी के अलगाव, शुद्धिकरण, पहचान और विशेषताओं को संक्षेप में प्रस्तुत करना आवश्यक है।
पिछले अध्ययन14 के अनुसार, एलएनसी मुख्य रूप से लिम्बल एपिथेलियम सबजेसेंट और लिम्बस के स्ट्रोमा में मौजूद होते हैं। इस प्रोटोकॉल में कोलेजनेज ए का उपयोग करके लिम्बस ऊतक का इलाज करना, एलईपीसी और एलएनसी से युक्त क्लस्टर प्राप्त करना और इसे 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (टीई) के साथ एकल कोशिकाओं में पचाना शामिल है। एलएनसी को तब शुद्ध करने के लिए एक संशोधित भ्रूण स्टेम सेल माध्यम (एमईएससीएम) में चुनिंदा रूप से सुसंस्कृत किया गया था। इस पत्र में रिपोर्ट प्रोटोकॉल सरल है और बड़ी मात्रा में मानव एलएनसी प्राप्त करने में उच्च दक्षता है.
एलएनसी अलगाव, संस्कृति और पहचान की विस्तृत प्रक्रिया एलएनसी अध्ययन में रुचि रखने वाले वैज्ञानिकों के लिए वीडियो में दर्ज की गई थी, और जरूरत पड़ने पर इसे आसानी से दोहराया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कॉर्नियल पारदर्शिता आम तौर पर नियमित रूप से व्यवस्था और कॉर्नियल स्ट्रोमा में छोटे फाइबर (व्यास में 25-30 एनएम) के वितरण द्वारा बनाए रखा जाता है, जो सामान्य दृष्टि तीक्ष्णता16 के लिए महत्वपूर्ण है…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम पर मार्गदर्शन के लिए वेई वांग, लिंगजुआन जू और रोंग लियू के लिए धन्यवाद, योंग्याओ टैन, बिहुई जिन, चुनक्सिउ यू, और ली गुइगांग को कुछ सामग्री प्रदान करने के लिए, पांडुलिपि लिखने के लिए गुआन्यू सु, जिओ झोउ, यिहोंग जिओन, और हुताओ झी पांडुलिपि को सही करने के लिए, और गुइगांग ली उनके पूर्ण मार्गदर्शन के लिए। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82070936, 81470606, 81570819), हुबेई प्रांत स्वास्थ्य और परिवार नियोजन वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना (सं। WJ2017M073), टोंगजी अस्पताल से शीर्ष दस अनुवादक चिकित्सा अनुसंधान परियोजनाएं (नंबर 2016ZHYX20), वुहान शहर में युवा चिकित्सा अग्रदूतों की प्रशिक्षण परियोजना (संख्या 2015whzqnyxggrc10), वैश्विक प्रतिभा भर्ती कार्यक्रम (G2022154028L), 2022 में हुबेई प्रांत परियोजना का राष्ट्रीय स्वास्थ्य आयोग (WJ2021ZH0005), और 2022 में हुबेई के वित्त विभाग का विषय निर्माण फाउंडेशन (42000022815T000000102)
Materials
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole | ThermoFisher | D1306 | 5μg/mL |
| Amphotericin B | Sigma | V900919 | 1.25 μg/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Bovine Serum Albumin | MERCK | A1933 | – |
| CD105 | Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 | Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Cell Incubator | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Centrifuge system | StatSpin | StatSpin CytoFuge 12 | – |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | – |
| Culture plate | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) | cytiva | SH30023.01 | 90% |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree Star | – |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | – |
| Fluorescence microscope | olympus | cx31 | |
| Gentamicin | Sigma | G1914 | 50 μg/mL |
| Hemocytometer | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| High-capacity cDNA Transcription Kit | ThermoFisher | 4374966 | |
| Inverted phase-contrast microscope | UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insulin, transferrin, sodium selenite) | Sigma | I3146 | 5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite |
| KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs | gibco | 10828-028 | 10% |
| Matrigel | BioCoat | 356234 | – |
| Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldehyde | NoninBio | NBS0135 | 4.00% |
| Paraformaldehyde | MKBio | MM-1505 | 4% |
| PDGFRβ | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Real-time fluorescence quantitative PCR instrument | Applied Biosystems | Step One Plus | – |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | – |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stereomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Sterile surgical round blade | Careforde | 29500 | size 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20% |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40% |
| Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25% |
| Tween 20 | MERCK | P9416 | – |
| Ultra Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim | Abcam | ab92547 | 1:100 |
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