Isolering og identifikation af limbal nicheceller

Summary

Her præsenterer vi en protokol til isolering og identifikation af de humane limbale nicheceller.

Abstract

Her rapporterer vi en standardprocedure til isolering og identifikation af limbal nicheceller (LNC’er). Limbusvæv opnået fra en øjenbank blev brugt til LNCs isolering. Vævet blev opdelt i 12 stykker under aseptiske forhold og fordøjet i 18 timer ved 37 °C i cellekulturinkubatoren under anvendelse af collagenase A for at opnå celleklynger med LNC’er og limkeepitelstamceller. Celleklyngerne blev yderligere fordøjet i 15 minutter ved 37 °C ved anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA for at opnå enkeltceller og derefter dyrket i modificeret embryonalt stamcellemedium (MESCM) på en plastoverflade belagt med 5% Matrigel. Celler blev passeret ved 70% sammenløb, og LNC’er blev identificeret ved anvendelse af immunofluorescens, kvantitativ PCR (qPCR) i realtid og flowcytometri. Primære LNC’er blev isoleret og passeret mere end 12 gange. LNC’ernes spredningsaktivitet fra P4 til P6 var den højeste. LNC’er udtrykte højere stamcellemarkører end BMMSC’er (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR og PDGFRβ). Desuden viste resultaterne, at P4 LNC’er ensartet udtrykte VIM, CD90, CD105 og PDGFRβ, men ikke Pan-CK, som kunne bruges som markør til identifikation af LNC’er. Flowcytometrisk analyse viste, at ca. 95%, 97%, 92% og 11% af LNC’erne udtrykte henholdsvis CD73, CD90, CD105 og SCF, mens de var 68%, 99%, 20% og 3% i BMMSC’er. Standardprocessen for LNC-isolering og -identifikation kunne udgøre et pålideligt laboratoriegrundlag for udbredt anvendelse af LNC’er.

Introduction

Forekomsten af hornhindeepitelstamcellemangel (CESD), også kaldet limbal stamcellemangel (LSCD)¹, og hornhindepitelregenerering (CES) bliver mere og mere presserende på grund af hornhindeinfektion og skade. Hvis CESD ikke behandles korrekt, kan det føre til blindhed, der kræver hornhindetransplantation. Som følge heraf bliver CES-regenerering mere betydningsfuld. Der er en gruppe af støttende celler kaldet limbal nicheceller (LNC’er), der giver væsentlig støtte til CES-funktion. Limbal stromale stamceller blev først isoleret af Polisetty et ^al.2 og identificeret af Xie et ^al.3 som LNC’er, der er lokaliseret i limbalepitel subjacent og stroma i limbus. LNC’er er den vigtigste understøttende stamcelle i hornhinderanden og med funktionen af knoglemarvsafledte MSC (BMMSC’er) og kan induceres til at udvikle sig til hornhindepitelceller og hornhindestromaceller osv.3,4,5,6,7. Tidligere undersøgelser viste, at stamcellekvaliteterne hos LNC’er er mere primitive end BMMSC⁸, som allerede er meget udbredt i klinikken. LNC’er kan endda blive den næste levedygtige mulighed efter MSC, især til behandling af CESD. Som vigtige støtteceller til CES er LNC’er også stamceller afledt af limbusens “niche” -struktur. LNC’er kan spille en central rolle i dedifferentieringen af modne hornhindeepitelceller (MCEC) til CES⁹. Undersøgelser af LNC’er er dog stadig relativt utilstrækkelige, og der er ingen konsensus om terminologi, isolering, oprensning, identifikation og karakteristika for LNC’er. Nogle forskere har navngivet LNC’er limbalbiopsiafledte stromale stamceller 10, limbal mesenkymale stamceller¹¹, limbalfibroblaststamceller 12 og limbal mesenkymale stromale celler¹³. Da vækstegenskaberne ved LNC’er ikke er beskrevet i detaljer og på grund af deres lovende videnskabelige og kliniske anvendelser og kan være et af de vigtigste kliniske værktøjer i fremtiden, er det nødvendigt at opsummere isolering, oprensning, identifikation og karakteristika ved LNC’er.

Ifølge en tidligere undersøgelse¹⁴ er LNC’er hovedsageligt til stede ved limbalepitel subjacent og stroma i limbus. Denne protokol omfatter behandling af limbusvæv ved hjælp af kollagenase A, opnåelse af en klynge bestående af LEPC og LNC’er og fordøjelse af det i enkeltceller med 0,25% trypsin-EDTA (TE). LNC’er blev derefter selektivt dyrket i et modificeret embryonalt stamcellemedium (MESCM), der skulle renses. Protokollen rapporteret i dette papir er enkel og har høj effektivitet til at opnå humane LNC’er i store mængder.

Den detaljerede procedure for LNC-isolering, kultur og identifikation blev optaget i videoen for forskere, der er interesseret i LNC-undersøgelse, og det kan bekvemt gentages, når det er nødvendigt.

Protocol

Limbusvæv fra donorer mellem 50 og 60 år blev opnået fra Røde Kors Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollen blev godkendt af Tongjis etiske komité og blev gennemført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. 1. Isolation Udtag limbusvæv fra mellemfristet hornhindelagringsmedium, og arbejd under aseptiske forhold på et ultrarent arbejdsbord. Skrab og fjern iris og endotel omkring hornhinden ved hjælp af et sterilt kirurgisk rundt …

Representative Results

Vækst af LNCLNC’erne blev med succes isoleret i henhold til metoden til nedbrydning af kollagenase A (2 mg/ml) fordøjelse af hornhindeoskleralt randvæv, som beskrevet ovenfor (figur 1). I overensstemmelse med en tidligere rapporteret undersøgelse3, efter kollagenase A-fordøjelse, blev larvelignende klynger visualiseret under mikroskopet (figur 2). Andelen af spindelceller steg gradvist med cellepassagen. Spindelf…

Discussion

Hornhindens gennemsigtighed opretholdes typisk ved regelmæssig arrangement og fordeling af små fibre (25-30 nm i diameter) i hornhindestromaet, hvilket er afgørende for normal synsstyrke¹⁶. Der er 253 millioner synshandicappede på verdensplan, hvoraf 36 millioner er blinde¹⁷. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) betragter hornhindeblindhed som en af de alvorligste farer for menneskets syn og tegner sig for 5,1 % af al blindhed på verdensplan¹⁶. H…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100