Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Abstract

Hier berichten wir über ein Standardverfahren zur Isolierung und Identifizierung von limbalen Nischenzellen (LNCs). Limbusgewebe aus einer Augenbank wurde für die Isolierung von LNCs verwendet. Das Gewebe wurde unter aseptischen Bedingungen in 12 Stücke geteilt und 18 h bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator unter Verwendung von Kollagenase A aufgeschlossen, um Zellcluster mit LNCs und limbalen Epithel-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Zellcluster wurden 15 Minuten lang bei 37 °C unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA verdaut, um Einzelzellen zu erhalten, und dann in modifiziertem embryonalem Stammzellmedium (MESCM) auf einer mit 5 % Matrigel beschichteten Kunststoffoberfläche kultiviert. Die Zellen wurden bei 70%iger Konfluenz durchgelassen und LNCs wurden mittels Immunfluoreszenz, quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) und Durchflusszytometrie identifiziert. Primäre LNCs wurden isoliert und mehr als 12 Mal durchquert. Die Proliferationsaktivität von LNCs von P4 bis P6 war am höchsten. LNCs exprimierten höhere Stammzellmarker als BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR und PDGFRβ). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass P4-LNCs einheitlich VIM, CD90, CD105 und PDGFRβ exprimierten, jedoch nicht Pan-CK, was als Marker für die Identifizierung von LNCs verwendet werden könnte. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 95 %, 97 %, 92 % und 11 % der LNCs CD73, CD90, CD105 bzw. SCF exprimierten, während sie bei BMMSCs 68 %, 99 %, 20 % und 3 % exprimierten. Das Standardverfahren zur LNC-Isolierung und -Identifizierung könnte eine zuverlässige Laborgrundlage für den weit verbreiteten Einsatz von LNCs bieten.

Introduction

Die Inzidenz von Hornhautepithelzellmangel (CESD), auch Limbusstammzellmangel (LSCD)¹ genannt, und Hornhautepithelregeneration (CES) wird aufgrund von Hornhautinfektionen und -verletzungen immer dringlicher. Wenn CESD nicht richtig behandelt wird, kann sie zur Erblindung führen, die eine Hornhauttransplantation erfordert. Dadurch gewinnt die CES-Regeneration an Bedeutung. Es gibt eine Gruppe von unterstützenden Zellen, die als limbale Nischenzellen (LNCs) bezeichnet werden und eine wesentliche Unterstützung für die CES-Funktion bieten. Limba-Stroma-Stammzellen wurden zuerst von Polisetty et ^al.2 isoliert und von Xie et ^al.3 als LNCs identifiziert, die im Limbusepithel und Stroma des Limbus lokalisiert sind. LNCs sind die wichtigsten unterstützenden Stammzellen des Hornhautrandes und könnten mit der Funktion von MSC aus dem Knochenmark (BMMSCs) dazu gebracht werden, sich zu Hornhautepithelzellen und Hornhautstromazellen usw. zu entwickeln.3,4,5,6,7. Frühere Studien zeigten, dass die Stammzellqualitäten von LNCs primitiver sind als die von BMMSCs⁸, die in der Klinik bereits weit verbreitet sind. LNCs könnten sogar die nächste praktikable Option nach MSC werden, insbesondere für die Behandlung von CESD. Als wichtige Stützzellen für CES sind LNCs auch Stammzellen, die aus der “Nischen”-Struktur des Limbus stammen. LNCs könnten eine Schlüsselrolle bei der Dedifferenzierung reifer Hornhautepithelzellen (MCEC) zu CES⁹ spielen. Die Studien zu LNCs sind jedoch noch relativ unzureichend, und es gibt keinen Konsens über die Terminologie, die Isolierung, die Reinigung, die Identifizierung und die Eigenschaften von LNCs. Einige Forscher haben LNCs aus der Limbusbiopsie gewonnene stromale Stammzellen¹⁰, limbale mesenchymale Stammzellen 11, limbale Fibroblasten-Stammzellen 12 und limbale mesenchymale Stromazellen¹³ genannt. Da die Wachstumseigenschaften von LNCs noch nicht im Detail beschrieben wurden und aufgrund ihrer vielversprechenden wissenschaftlichen und klinischen Anwendungen in Zukunft eines der wichtigsten klinischen Werkzeuge sein könnten, ist es notwendig, die Isolierung, Aufreinigung, Identifizierung und Eigenschaften von LNCs zusammenzufassen.

Laut einer früheren Studie¹⁴ sind LNCs hauptsächlich am Limbusepithel und Stroma des Limbus vorhanden. Dieses Protokoll umfasst die Behandlung von Limbusgewebe mit Kollagenase A, die Gewinnung eines Clusters aus LEPC und LNCs und die Verdauung in einzelne Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA (TE). LNCs wurden dann selektiv in einem modifizierten embryonalen Stammzellmedium (MESCM) kultiviert, um gereinigt zu werden. Das Protokoll, über das in diesem Artikel berichtet wird, ist einfach und hat eine hohe Effizienz bei der Gewinnung menschlicher LNCs in großen Mengen.

Das detaillierte Verfahren der LNC-Isolierung, -Kultur und -Identifizierung wurde in dem Video für Wissenschaftler aufgezeichnet, die an einer LNC-Studie interessiert sind, und kann bei Bedarf bequem wiederholt werden.

Protocol

Limbusgewebe von Spendern im Alter zwischen 50 und 60 Jahren wurde von der Augenbank des Roten Kreuzes im Tongji-Krankenhaus (Wuhan, China) gewonnen. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Tongji genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. 1. Isolierung Gewinnen Sie Limbusgewebe aus einem mittelfristigen Hornhautspeichermedium und arbeiten Sie unter aseptischen Bedingungen auf einer ultrareinen Werkbank. Kratze…

Representative Results

Wachstum von LNCDie LNCs wurden erfolgreich gemäß der Methode des Verdaus von Kollagenase A (2 mg/ml) des korneoskleralen Randgewebes, wie oben beschrieben (Abbildung 1), isoliert. In Übereinstimmung mit einer zuvor berichteten Studie3 wurden nach dem Verdau von Kollagenase A raupenartige Cluster unter dem Mikroskop sichtbar gemacht (Abbildung 2). Der Anteil der Spindelzellen nahm mit der Zellpassage allmählich zu…

Discussion

Die Transparenz der Hornhaut wird in der Regel durch die regelmäßige Anordnung und Verteilung kleiner Fasern (25-30 nm Durchmesser) im Hornhautstroma aufrechterhalten, was für die normale Sehschärfe entscheidend ist¹⁶. Weltweit gibt es 253 Millionen sehbehinderte Menschen, von denen 36 Millionen blind sind¹⁷. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) betrachtet Hornhautblindheit als eine der schwerwiegendsten Gefahren für das menschliche Sehvermögen und macht 5,1 % aller …

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100