Isolement et identification des cellules de niche limbique

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.

Abstract

Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.

Introduction

L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)¹, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées....

Protocol

Les tissus Limbus provenant de donneurs âgés de 50 à 60 ans ont été obtenus auprès de la banque d’yeux de la Croix-Rouge de l’hôpital de Tongji (Wuhan, Chine). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de Tongji et a été mené conformément à la Déclaration d’Helsinki.

1. Isolement

1. Obtenir du tissu limbique à partir d’un milieu de stockage cornéen à moyen terme et opérer dans des conditions aseptiques sur un établi ultra-propre.
2. Grattez et retirez l’iris et l’endothélium autour de la cornée à l’aide d’une lame ronde chirurgicale stérile.
3. Coupez le tissu limbique en douze morceaux de tai....

Results

Croissance de LNC
Les LNC ont été isolés avec succès selon la méthode de digestion de la collagénase A (2 mg/mL) du tissu cornéo-scléral, telle que décrite ci-dessus (Figure 1). Conformément à une étude précédemment rapportée³, après la digestion de la collagénase A, des amas ressemblant à des chenilles ont été visualisés au microscope (Figure 2). La proportion de cellules fusiformes augmentait progressivement avec le .......

Discussion

La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale¹⁶. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles¹⁷. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représentant 5,1 % de toutes l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phénylindole	ThermoFisher	D1306	5&mu ; g/mL
d’amphotéricine B	Sigma	V900919	1,25 &mu ; g/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Albumine sérique bovine	MERCK	A1933-CD105
	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90 Proteintech		66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Incubateur cellulaire	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Système de centrifugation	StatSpin  ;	StatSpin CytoFuge	12-Collagenase
A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Microscope confocal	Zeiss  ;	LSM700-Plaque
de culture	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)  ;	cytiva	SH30023.01	90 %
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree	Star-Flow
Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	-
Microscope à fluorescence	olympus	cx31  ;
Gentamicine	Sigma	G1914	50 &mu ; g/mL
Hémocytomètre	MERCK	Z359629	Bright-Line
Kit de transcription d’ADNc haute capacité	ThermoFisher	4374966
Microscope à contraste de phase inversé	; UOP	DSZ2000X
ITS (insuline, transferrine, sélénite de sodium)	Sigma	I3146	5 &mu ; g/mL d’insuline, 5 &mu ; g/mL de transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium
KnockOut SR Sérum de remplacement pour ESC/iPSC	gibco	10828-028	10 %
Matrigel	BioCoat
356234-Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldéhyde	NoninBio	NBS0135	4,00
Paraformaldéhyde	MKBio	MM-1505	4 %
PDGFR&beta ;	Abclonal	A1444	1:100
Instrument de PCR quantitative par fluorescence en temps réel	Applied Biosystems	Step One	Plus-Recombinant
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Facteur inhibiteur de la leucémie humaine recommandée (Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini Kit d’isolement d’ARN	Qiagen	74104	-
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stéréomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Lame ronde chirurgicale stérile	Careforde	29500	taille 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20 %
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40
%Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25 %
Tween 20	MERCK	P9416-Ultra
Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim  ;	Abcam	ab92547	1:100