Isolering och identifiering av limbala nischceller

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och identifiera de humana limbala nischcellerna.

Abstract

Här redovisar vi en standardprocedur för isolering och identifiering av limbala nischceller (LNC). Limbusvävnad erhållen från en ögonbank användes för isolering av LNC. Vävnaden delades i 12 delar under aseptiska förhållanden och spjälkades i 18 timmar vid 37 °C i cellodlingsinkubatorn med kollagenas A för att erhålla cellkluster med LNC och limbala epitelceller. Cellklustren rötades vidare i 15 minuter vid 37 °C med 0,25 % trypsin-EDTA för att erhålla enskilda celler och odlades sedan i modifierat embryonalt stamcellsmedium (MESCM) på en plastyta belagd med 5 % Matrigel. Celler passerade vid 70 % sammanflöde och LNC identifierades med hjälp av immunofluorescens, kvantitativ PCR (qPCR) i realtid och flödescytometri. Primära LNC isolerades och passerade mer än 12 gånger. Spridningsaktiviteten för LNC från P4 till P6 var den högsta. LNC uttryckte högre stamcellsmarkörer än BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR och PDGFRβ). Vidare visade resultaten att P4 LNC enhetligt uttryckte VIM, CD90, CD105 och PDGFRβ, men inte Pan-CK, som kunde användas som en markör för identifiering av LNCs. Flödescytometrisk analys visade att cirka 95 %, 97 %, 92 % och 11 % av LNC uttryckte CD73, CD90, CD105 respektive SCF, medan de var 68 %, 99 %, 20 % och 3 % i BMMSCs. Standardprocessen för isolering och identifiering av LNC skulle kunna ge en tillförlitlig laboratoriegrund för en utbredd användning av LNC.

Introduction

Förekomsten av hornhinneepitelstamcellsbrist (CESD), även kallad limbal stamcellsbrist (LSCD)¹, och hornhinneepitelregenerering (CES) blir mer och mer akut på grund av hornhinneinfektion och hornhinneskada. Om CESD inte behandlas på rätt sätt kan det leda till blindhet som kräver hornhinnetransplantation. Som ett resultat av detta blir CES-regenerering allt viktigare. Det finns en grupp stödceller som kallas limbala nischceller (LNC) som ger viktigt stöd för CES-funktionen. Limbala stromastamceller isolerades först av Polisetty et ^al.2 och identifierades av Xie et ^al.3 som LNC som är lokaliserade i limbalt epitel subjacent och stroma i limbus. LNC är den viktigaste stödjande stamcellen i hornhinnans kant och med funktionen av benmärgshärledd MSC (BMMSC), och kan induceras att utvecklas till hornhinneepitelceller och hornhinnestromaceller, etc.3,4,5,6,7. Tidigare studier har visat att stamcellsegenskaperna hos LNC är mer primitiva än BMMSCs⁸, som redan används i stor utsträckning i kliniken. LNC kan till och med bli nästa gångbara alternativ efter MSC, särskilt för behandling av CESD. Som viktiga stödceller för CES är LNC också stamceller som härrör från limbus “nisch”-struktur. LNC kan spela en nyckelroll i dedifferentieringen av mogna hornhinneepitelceller (MCEC) till CES⁹. Studier om LNC är dock fortfarande relativt otillräckliga, och det finns ingen konsensus om terminologin, isoleringen, reningen, identifieringen och egenskaperna hos LNC. Vissa forskare har namngett LNCs limbala biopsi-härledda stromastamceller¹⁰, limbala mesenkymala stamceller 11, limbala fibroblaststamceller 12 och limbala mesenkymala stromaceller¹³. Eftersom tillväxtkarakteristika för LNC inte har beskrivits i detalj, och på grund av deras lovande vetenskapliga och kliniska tillämpningar, och kan vara ett av de viktigaste kliniska verktygen i framtiden, är det nödvändigt att sammanfatta isolering, rening, identifiering och egenskaper hos LNC.

Enligt en tidigare studie¹⁴ finns LNC huvudsakligen vid limbalt epitel subjacent och stroma i limbus. Detta protokoll inkluderar behandling av limbusvävnad med kollagenas A, erhållande av ett kluster bestående av LEPC och LNC och nedbrytning av det till enstaka celler med 0,25 % trypsin-EDTA (TE). LNC odlades sedan selektivt i ett modifierat embryonalt stamcellsmedium (MESCM) för att renas. Protokollet som rapporteras i detta dokument är enkelt och har hög effektivitet när det gäller att erhålla mänskliga LNC i stora mängder.

Den detaljerade proceduren för LNC-isolering, odling och identifiering spelades in i videon för forskare som är intresserade av LNC-studier, och den kan bekvämt upprepas vid behov.

Protocol

Limbusvävnad från donatorer mellan 50 och 60 år erhölls från Röda Korsets Ögonbank, Tongji Hospital (Wuhan, Kina). Protokollet godkändes av Tongjis etiska kommitté och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen. 1. Isolering Skaffa limbusvävnad från mellanliggande hornhinnelagringsmedium och arbeta under aseptiska förhållanden på en ultraren arbetsbänk. Skrapa och ta bort iris och endotelet runt hornhinnan med ett sterilt kirurgiskt…

Representative Results

Tillväxt av LNCLNC isolerades framgångsrikt enligt metoden för uppslutning av kollagenas A (2 mg/ml) uppslutning av corneoscleral kantvävnad, som beskrivits ovan (Figur 1). I överensstämmelse med en tidigare rapporterad studie3, efter kollagenas A-nedbrytning, visualiserades larvliknande kluster under mikroskopet (Figur 2). Andelen spindelceller ökade gradvis med cellpassagen. Spindelformade celler kunde växa …

Discussion

Hornhinnans transparens upprätthålls vanligtvis genom regelbunden placering och fördelning av små fibrer (25-30 nm i diameter) i hornhinnans stroma, vilket är avgörande för normal synskärpa¹⁶. Det finns 253 miljoner synskadade i världen, varav 36 miljoner^{är blinda}. Världshälsoorganisationen (WHO) anser att hornhinneblindhet är en av de allvarligaste farorna för människans syn och står för 5,1 % av all blindhet i världen¹⁶. Hornhinne…

Materials

4',6-Diamidino-2-Phenylindole	ThermoFisher	D1306	5μg/mL
Amphotericin B	Sigma	V900919	1.25 μg/mL
Anti-CD73	Abcam	ab202122	1:50
Bovine Serum Albumin	MERCK	A1933	–
CD105	Proteintech	67075-1-Ig	1:200
CD105	Abcam	ab114052	1:50
CD90	Proteintech	66766-1-Ig	1:100
CD90	Abcam	ab307736	1:50
Cell Incubator	Shanghai Lishen	K1119K4644	HF90(HT)
Centrifuge system	StatSpin	StatSpin CytoFuge 12	–
Collagenase A	Roche	10103578001	2 mg/mL
Confocal microscope	Zeiss	LSM700	–
Culture plate	virya	3500356	35 mm
DME/F-12 1:1 (1x)	cytiva	SH30023.01	90%
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A16016	1:1000
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	31568	1:1000
FACS Diva sofware	BD Biosciences	Tree Star	–
Flow Cytometer	BD Biosciences	Becton Dickinson LSRII	–
Fluorescence microscope	olympus	cx31
Gentamicin	Sigma	G1914	50 μg/mL
Hemocytometer	MERCK	Z359629	Bright-Line
High-capacity cDNA Transcription Kit	ThermoFisher	4374966
Inverted phase-contrast microscope	UOP	DSZ2000X
ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)	Sigma	I3146	5 μg/mL insulin, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite
KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs	gibco	10828-028	10%
Matrigel	BioCoat	356234	–
Pan-CK	Abcam	ab7753	1:1000
Paraformaldehyde	NoninBio	NBS0135	4.00%
Paraformaldehyde	MKBio	MM-1505	4%
PDGFRβ	Abclonal	A1444	1:100
Real-time fluorescence quantitative PCR instrument	Applied Biosystems	Step One Plus	–
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B	4 ng/mL
Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)	Peprotech	300-05	10 ng/mL
RNeasy Mini RNA Isolation Kit	Qiagen	74104	–
SCF	Bioss	bs-0545R	1:100
SCF	Abcam	ab52603	1:50
Stereomicroscope	ZEISS	SteREO Discovery. V8
Sterile surgical round blade	Careforde	29500	size 10
TaqMan Gene Expression Assay Mix	Applied Biosystems	4448489
Triton X-100	MERCK	X100	0.20%
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	0.40%
Trypsin-EDTA	Genview	GP3108	0.25%
Tween 20	MERCK	P9416	–
Ultra Clean Bench	LaiTe	LT20200705	SW-CJ-IFDG
Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Vim	Abcam	ab92547	1:100