هنا ، نقدم استخراج وإعداد المستقلبات القطبية وشبه القطبية من holobiont المرجانية ، وكذلك الأنسجة المضيفة المرجانية المنفصلة وكسور خلايا Symbiodiniaceae ، لتحليل مطياف الكتلة اللوني الغازي.
أثبتت الأساليب القائمة على قياس الطيف الكتلي اللوني للغاز (GC-MS) أنها قوية لتوضيح الأساس الأيضي لتكافل cnidarian-dinoflagellate وكيف يستجيب المرجان للإجهاد (أي أثناء التبييض الناجم عن درجة الحرارة). تم تطبيق التنميط المستقلب في الحالة المستقرة للهولوبيونت المرجاني ، والذي يضم المضيف cnidarian والميكروبات المرتبطة به (Symbiodiniaceae وغيرها من الطلائعيات والبكتيريا والعتائق والفطريات والفيروسات) بنجاح في ظل الظروف المحيطة والإجهاد لتوصيف الحالة الأيضية الشاملة للمرجان.
ومع ذلك ، للإجابة على الأسئلة المحيطة بالتفاعلات التكافلية ، من الضروري تحليل ملامح الأيض للمضيف المرجاني وتعايشاته الطحلبية بشكل مستقل ، والتي لا يمكن تحقيقها إلا عن طريق الفصل المادي وعزل الأنسجة ، يليها استخراج وتحليل مستقل. في حين أن تطبيق الأيض جديد نسبيا في مجال المرجان ، فقد أدت الجهود المستمرة لمجموعات البحث إلى تطوير طرق قوية لتحليل المستقلبات في الشعاب المرجانية ، بما في ذلك فصل الأنسجة المضيفة المرجانية والطحالب المتعايشة.
تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا لفصل holobiont واستخراج المستقلبات لتحليل GC-MS ، بما في ذلك خطوات التحسين الرئيسية للنظر فيها. نوضح كيف ، بمجرد تحليلها بشكل مستقل ، فإن ملف الأيض المشترك للجزأين (المرجان و Symbiodiniaceae) يشبه ملف تعريف الكل (holobiont) ، ولكن من خلال فصل الأنسجة ، يمكننا أيضا الحصول على معلومات أساسية حول التمثيل الغذائي والتفاعلات بين الشريكين التي لا يمكن الحصول عليها من الكل وحده.
تمثل المستقلبات المنتجات النهائية للعمليات الخلوية ، ويمكن أن توفر الأيضات – دراسة مجموعة المستقلبات التي ينتجها كائن حي أو نظام بيئي معين – مقياسا مباشرا لعمل الكائن الحي1. وهذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص لاستكشاف النظم الإيكولوجية والتفاعلات التكافلية وأدوات الاستعادة ، حيث أن الهدف من معظم استراتيجيات الإدارة هو الحفاظ على (أو استعادة) وظائف خدمة النظام الإيكولوجي المحددة2. الشعاب المرجانية هي أحد النظم الإيكولوجية المائية التي توضح القيمة المحتملة لعملية التمثيل الغذائي لتوضيح التفاعلات التكافلية وربط الاستجابات الفسيولوجية المرجانية بالتأثيرات على مستوى المجتمع ومستوى النظام الإيكولوجي3. يحظى تطبيق قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز عالي الإنتاجية (GC-MS) بتقدير خاص نظرا لقدرته على التحليل السريع لمجموعة واسعة من فئات الأيض في وقت واحد بانتقائية وحساسية عالية ، وتوفير تحديد سريع للمركب عند توفر المكتبات الطيفية ، وتوفير مستوى عال من التكرار والدقة ، بتكلفة منخفضة نسبيا لكل عينة.
الشعاب المرجانية هي holobionts تتكون من المرجان ، و endosymbionts dinoflagellate الضوئي (العائلة: Symbiodiniaceae4) ، وميكروبيوم معقد 5,6. بشكل عام ، يتم الحفاظ على لياقة holobiont في المقام الأول من خلال تبادل الجزيئات والعناصر الصغيرة لدعم الأداء الأيضي لكل عضو7،8،9،10. أثبتت الأساليب الأيضية أنها قوية بشكل خاص لتوضيح الأساس الأيضي لخصوصية التكافل 9,11 ، واستجابة التبييض للإجهاد الحراري7،8،12،13 ، واستجابات المرض 14 ، واستجابات التعرض للتلوث 15 ، والتأقلم الضوئي 16 ، والإشارات الكيميائية 17 في الشعاب المرجانية ، وكذلك المساعدة في اكتشاف العلامات الحيوية 18، 19. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر الأيضات تأكيدا قيما للاستنتاجات المستنتجة من التقنيات القائمة على الحمض النووي والحمض النووي الريبي9،20. لذلك ، هناك إمكانات كبيرة لاستخدام الأيض لتقييم صحة الشعاب المرجانية وتطوير أدوات للحفاظ على الشعاب المرجانية3 ، مثل من خلال الكشف عن المؤشرات الحيوية الأيضية للإجهاد18,19 ولدراسة إمكانات استراتيجيات الإدارة النشطة مثل الإعانات الغذائية21.
يمكن أن يؤدي فصل الخلايا المضيفة والخلايا المتعايشة وتحليل ملفات تعريف الأيض الخاصة بها بشكل مستقل ، بدلا من تجميعها معا مثل holobiont ، إلى مزيد من المعلومات حول تفاعلات الشريك ، والحالات الفسيولوجية والأيضية المستقلة ، والآليات الجزيئية المحتملة للتكيف11،12،22،23،24. بدون فصل المرجان و Symbiodiniaceae ، يكاد يكون من المستحيل توضيح مساهمة واستقلاب المرجان و / أو Symbiodiniaceae بشكل مستقل ، باستثناء إعادة بناء الجينوم المعقدة والنمذجة الأيضية25 ، ولكن هذا لم يتم تطبيقه بعد على تكافل المرجان ثنائي السوط. علاوة على ذلك ، فإن محاولة استخراج معلومات حول التمثيل الغذائي الفردي للمضيف أو الطحالب المتعايشة من ملف الأيض الخاص بالهولوبيونت يمكن أن يؤدي إلى سوء التفسير.
على سبيل المثال ، حتى وقت قريب ، كان يعتقد أن وجود الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة C18: 3n-6 و C18: 4n-3 و C16 في مستخلصات من أنسجة المرجان و holobiont مشتق من الطحالب المتكافلة ، حيث كان من المفترض أن الشعاب المرجانية لا تمتلك ωx desaturases الأساسية لإنتاج أحماض أوميغا 3 الدهنية (ω3) ؛ ومع ذلك ، تشير الأدلة الجينومية الحديثة إلى أن العديد من cnidarians لديهم القدرة على إنتاج ω3 PUFA de novo والمزيد من التخليق الحيوي ω3 PUFA26 طويل السلسلة. يمكن استخدام الجمع بين GC-MS مع وضع العلامات النظيرية المستقرة (على سبيل المثال ، 13 C-bicarbonate ، NaH13CO 3) لتتبع مصير الكربون الثابت ضوئيا من خلال شبكات التمثيل الغذائي holobiont المرجانية في ظل ظروف التحكم واستجابة للضغوط الخارجية27,28. ومع ذلك ، فإن الخطوة الحاسمة في تتبع مصير 13 C هي فصل الأنسجة المرجانية عن خلايا الطحالب – عندها فقط يمكن تعيين وجود مركب يحمل علامة 13C في جزء مضيف المرجان بشكل لا لبس فيه كمستقلب مشتق من Symbiodiniaceae يتم نقله إلى المرجان أو منتج مصب لمركب مسمى منقولة. أثبتت هذه التقنية قوتها من خلال تحدي الافتراض السائد منذ فترة طويلة بأن الجلسرين هو الشكل الأساسي الذي يتم فيه نقل التمثيل الضوئي من المتعايش إلى المضيف29 ، بالإضافة إلى توضيح كيفية تغير التدفق الغذائي بين الشركاء أثناء التبييض27,28 واستجابة لأنواع Symbiodiniaceae غير المتوافقة11.
في حين أن قرار فصل الأنسجة مدفوع في المقام الأول بسؤال البحث ، فإن التطبيق العملي والموثوقية والتأثيرات الأيضية المحتملة لهذا النهج مهمة في الاعتبار. هنا ، نقدم طرقا مفصلة ومثبتة لاستخراج المستقلبات من holobiont ، بالإضافة إلى الكسور المضيفة والمتعايشة المنفصلة. نقارن ملامح الأيض للمضيف والمتعايش بشكل مستقل وكيف تقارن هذه الملفات الشخصية بملف تعريف مستقلب holobiont.
يمكن تحقيق فصل المضيف والمتعايش بسهولة وسرعة عن طريق الطرد المركزي البسيط ، وتظهر النتائج هنا أن فصل الكسور يمكن أن يوفر معلومات قيمة تشير إلى مساهمات محددة لأعضاء holobiont ، والتي يمكن أن تسهم في التحليل الوظيفي لصحة المرجان. في الشعاب المرجانية البالغة ، يتم إجراء تخليق الدهون بشكل أس?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم JLM من قبل زمالة أبحاث مستشار UTS.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |