Hier presenteren we de extractie en bereiding van polaire en semi-polaire metabolieten uit een koraalholobiont, evenals gescheiden koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae celfracties, voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse.
Op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) gebaseerde benaderingen hebben bewezen krachtig te zijn voor het ophelderen van de metabole basis van de symbiose tussen cnidarian en dinoflagellaat en hoe koraal reageert op stress (d.w.z. tijdens temperatuurgeïnduceerde bleking). Steady-state metabolietprofilering van het koraalholobiont, dat de cnidarian-gastheer en de bijbehorende microben (Symbiodiniaceae en andere protisten, bacteriën, archaea, schimmels en virussen) omvat, is met succes toegepast onder omgevings- en stressomstandigheden om de holistische metabole status van het koraal te karakteriseren.
Om vragen over de symbiotische interacties te beantwoorden, is het echter noodzakelijk om de metabolietprofielen van de koraalgastheer en zijn algensymbionten onafhankelijk te analyseren, wat alleen kan worden bereikt door fysieke scheiding en isolatie van de weefsels, gevolgd door onafhankelijke extractie en analyse. Hoewel de toepassing van metabolomics relatief nieuw is in het koraalveld, hebben de aanhoudende inspanningen van onderzoeksgroepen geresulteerd in de ontwikkeling van robuuste methoden voor het analyseren van metabolieten in koralen, inclusief de scheiding van het koraalgastheerweefsel en algensymbionten.
Dit artikel presenteert een stapsgewijze handleiding voor holobiont-scheiding en de extractie van metabolieten voor GC-MS-analyse, inclusief belangrijke optimalisatiestappen ter overweging. We laten zien hoe, eenmaal onafhankelijk geanalyseerd, het gecombineerde metabolietprofiel van de twee fracties (koraal en Symbiodiniaceae) vergelijkbaar is met het profiel van het geheel (holobiont), maar door de weefsels te scheiden, kunnen we ook belangrijke informatie verkrijgen over het metabolisme van en interacties tussen de twee partners die niet alleen uit het geheel kan worden verkregen.
Metabolieten vertegenwoordigen de eindproducten van cellulaire processen, en metabolomics – de studie van de reeks metabolieten die door een bepaald organisme of ecosysteem worden geproduceerd – kan een directe maatstaf zijn voorhet functioneren van het organisme. Dit is met name van cruciaal belang voor het verkennen van ecosystemen, symbiotische interacties en herstelinstrumenten, aangezien het doel van de meeste beheerstrategieën is om specifieke ecosysteemdienstfuncties te behouden (of te herstellen)2. Koraalriffen zijn een aquatisch ecosysteem dat de potentiële waarde van metabolomics aantoont voor het ophelderen van symbiotische interacties en het koppelen van fysiologische reacties van koraal aan effecten op gemeenschaps- en ecosysteemniveau3. De toepassing van high-throughput gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt vooral gewaardeerd vanwege het vermogen om snel een breed scala aan metabolietklassen gelijktijdig te analyseren met een hoge selectiviteit en gevoeligheid, een snelle identificatie van verbindingen te bieden wanneer spectrale bibliotheken beschikbaar zijn, en een hoge mate van reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid te bieden, met relatief lage kosten per monster.
Koralen zijn holobionten die bestaan uit het koraaldier, fotosynthetische dinoflagellaat-endosymbionten (familie: Symbiodiniaceae4) en een complex microbioom 5,6. Over het algemeen wordt de fitheid van de holobiont voornamelijk gehandhaafd door de uitwisseling van kleine moleculen en elementen om het metabolisch functioneren van elk lid te ondersteunen 7,8,9,10. Metabolomische benaderingen zijn bijzonder krachtig gebleken voor het ophelderen van de metabole basis van symbiosespecificiteit9,11, de bleekreactie op thermische stress 7,8,12,13, ziektereacties 14, blootstellingsreacties aan vervuiling 15, fotoacclimatisatie 16 en chemische signalering 17 bij koralen, evenals bij het helpen ontdekken van biomarkers 18,19. Bovendien kan metabolomics een waardevolle bevestiging bieden van de conclusies die worden afgeleid uit DNA- en RNA-gebaseerde technieken 9,20. Er is daarom een aanzienlijk potentieel voor het gebruik van metabolomics voor het beoordelen van de gezondheid van riffen en het ontwikkelen van instrumenten voor het behoud van riffen3, zoals door de detectie van metabole biomarkers van stress18,19 en voor het onderzoeken van het potentieel van actieve beheerstrategieën zoals voedingssubsidies21.
Het scheiden van de gastheer- en symbiontecellen en het onafhankelijk analyseren van hun metabolietprofielen, in plaats van samen als de holobiont, kan meer informatie opleveren over de partnerinteracties, onafhankelijke fysiologische en metabole statussen en mogelijke moleculaire mechanismen voor aanpassing 11,12,22,23,24. Zonder het koraal en de Symbiodiniaceae te scheiden, is het bijna onmogelijk om de bijdrage en het metabolisme van koraal en/of Symbiodiniaceae onafhankelijk van elkaar op te helderen, behalve met complexe genoomreconstructie en metabole modellering25, maar dit moet nog worden toegepast op de symbiose tussen koraal en dinoflagellaat. Bovendien kan een poging om informatie over het individuele metabolisme van de gastheer of algensymbiont uit het metabolietprofiel van de holobiont te halen, leiden tot verkeerde interpretatie.
Tot voor kort werd bijvoorbeeld gedacht dat de aanwezigheid van C18:3n-6, C18:4n-3 en C16 meervoudig onverzadigde vetzuren in extracten van koraal- en holobiontweefsels afkomstig was van de algensymbiont, omdat werd aangenomen dat koralen niet de ωx-desaturaten bezitten die essentieel zijn voor de productie van omega-3 (ω3) vetzuren; recent genoombewijs suggereert echter dat meerdere cnidarians het vermogen hebben om ω3 PUFA de novo te produceren en ω3 PUFA met lange keten verder te biosynthetiseren26. Het combineren van GC-MS met stabiele isotopenetikettering (bijv. 13 C-bicarbonaat, NaH 13CO3) kan worden gebruikt om het lot van fotosynthetisch gefixeerde koolstof te volgen via koraalholobiont-metabole netwerken onder zowel controleomstandigheden als als reactie op externe stressoren27,28. Een cruciale stap in het volgen van het lot van 13 C is echter de scheiding van het koraalweefsel van de algencellen – alleen dan kan de aanwezigheid van een 13C-gelabelde verbinding in de koraalgastheerfractie ondubbelzinnig worden toegewezen als een van Symbiodiniaceae afgeleide metaboliet die naar hetkoraal wordt verplaatst of een stroomafwaarts product van een getransloceerde gelabelde verbinding. Deze techniek heeft zijn kracht bewezen door de lang gekoesterde veronderstelling uit te dagen dat glycerol de primaire vorm is waarin fotosynthese wordt verplaatst van symbiont naar gastheer29, en door op te helderen hoe de voedingsflux tussen partners verandert tijdens het bleken27,28 en als reactie op incompatibele Symbiodiniaceae species11.
Hoewel de beslissing om weefsels te scheiden voornamelijk wordt gedreven door de onderzoeksvraag, zijn de bruikbaarheid, betrouwbaarheid en potentiële metabole effecten van deze aanpak belangrijk om te overwegen. Hier bieden we gedetailleerde, gedemonstreerde methoden voor de extractie van metabolieten uit de holobiont, evenals de afzonderlijke gastheer- en symbiontenfracties. We vergelijken de metabolietprofielen van de gastheer en symbiont onafhankelijk van elkaar en hoe deze profielen zich verhouden tot het holobiontmetabolietprofiel.
De scheiding van de gastheer en de symbiont is gemakkelijk en snel haalbaar via eenvoudige centrifugatie, en de resultaten hier laten zien dat het scheiden van de fracties waardevolle informatie kan opleveren die wijst op specifieke bijdragen van holobiont-leden, die kunnen bijdragen aan de functionele analyse van de gezondheid van koraal. Bij volwassen koralen wordt de lipidensynthese voornamelijk uitgevoerd door de residente algensymbiont40, die lipiden levert (bijv. triacylglycerol en …
The authors have nothing to disclose.
J.L.M. werd ondersteund door een UTS Chancellor’s Research Fellowship.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |