Metabolômica Direcionada Baseada em Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas de Amostras de Corais Duros
Summary
Aqui, apresentamos a extração e preparação de metabólitos polares e semipolares de um holobionte de coral, bem como tecido hospedeiro coral separado e frações celulares de Symbiodiniaceae, para análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
Abstract
Abordagens baseadas em cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS) provaram ser poderosas para elucidar a base metabólica da simbiose cnidário-dinoflagelado e como os corais respondem ao estresse (isto é, durante o branqueamento induzido pela temperatura). O perfil de metabólitos em estado estacionário do holobionte do coral, que compreende o hospedeiro cnidário e seus micróbios associados (Symbiodiniaceae e outros protistas, bactérias, arqueias, fungos e vírus), tem sido aplicado com sucesso sob condições ambientais e de estresse para caracterizar o estado metabólico holístico do coral.
No entanto, para responder às questões que envolvem as interações simbióticas, é necessário analisar os perfis de metabólitos do hospedeiro coral e seus simbiontes algais de forma independente, o que só pode ser alcançado pela separação física e isolamento dos tecidos, seguido de extração e análise independentes. Embora a aplicação da metabolômica seja relativamente nova no campo dos corais, os esforços sustentados de grupos de pesquisa resultaram no desenvolvimento de métodos robustos para analisar metabólitos em corais, incluindo a separação do tecido hospedeiro dos corais e dos simbiontes algais.
Este artigo apresenta um guia passo-a-passo para a separação de holobiontes e a extração de metabólitos para análise de CG-EM, incluindo os principais passos de otimização para consideração. Demonstramos como, uma vez analisado independentemente, o perfil combinado de metabólitos das duas frações (coral e Symbiodiniaceae) é semelhante ao perfil do todo (holobionte), mas separando os tecidos, também podemos obter informações importantes sobre o metabolismo e as interações entre os dois parceiros que não podem ser obtidas do todo isoladamente.
Introduction
Metabólitos representam os produtos finais dos processos celulares, e a metabolômica – o estudo do conjunto de metabólitos produzidos por um determinado organismo ou ecossistema – pode fornecer uma medida direta do funcionamento do organismo1. Isso é particularmente crítico para explorar ecossistemas, interações simbióticas e ferramentas de restauração, já que o objetivo da maioria das estratégias de manejo é preservar (ou restaurar) funções específicas de serviços ecossistêmicos2. Os recifes de coral são um ecossistema aquático que demonstra o valor potencial da metabolômica para elucidar interações simbióticas e ligar as respostas fisiológicas dos corais aos impactos em nível de comunidade e ecossistema3. A aplicação de cromatografia gasosa de alto rendimento-espectrometria de massas (GC-MS) é especialmente valorizada devido à sua capacidade de analisar rapidamente uma ampla gama de classes de metabólitos simultaneamente com alta seletividade e sensibilidade, fornecer rápida identificação de compostos quando bibliotecas espectrais estão disponíveis e fornecer um alto nível de reprodutibilidade e precisão, com um custo relativamente baixo por amostra.
Os corais são holobiontes constituídos pelo animal coral, endossimbiontes dinoflagelados fotossintéticos (família: Symbiodiniaceae4) e um microbioma complexo 5,6. De modo geral, a aptidão do holobionte é mantida principalmente através da troca de pequenas moléculas e elementos para apoiar o funcionamento metabólico de cada membro 7,8,9,10. As abordagens metabolômicas têm se mostrado especialmente poderosas para elucidar as bases metabólicas da especificidade da simbiose9,11, a resposta clareadora ao estresse térmico 7,8,12,13, as respostas à doença 14, as respostas à exposição à poluição 15, a fotoaclimatação 16 e a sinalização química 17 em corais, além de auxiliar na descoberta de biomarcadores 18,19. Além disso, a metabolômica pode fornecer confirmação valiosa das conclusões inferidas a partir de técnicas baseadas em DNA eRNA9,20. Há, portanto, considerável potencial para o uso de metabolômicas para avaliar a saúde recifal e desenvolver ferramentas para a conservação recifal3, como por meio da detecção de biomarcadores metabólicos de estresse18,19 e para examinar o potencial de estratégias de manejo ativo, como subsídios nutricionais21.
Separar as células hospedeiras e simbiontes e analisar seus perfis metabólicos de forma independente, em vez de juntos como o holobionte, pode fornecer mais informações sobre as interações do parceiro, estados fisiológicos e metabólicos independentes e potenciais mecanismos moleculares de adaptação 11,12,22,23,24. Sem separar o coral e Symbiodiniaceae, é quase impossível elucidar a contribuição e o metabolismo de corais e/ou Symbiodiniaceae de forma independente, exceto com reconstrução complexa do genoma e modelagem metabólica25, mas isso ainda não foi aplicado à simbiose coral-dinoflagelado. Além disso, tentar extrair informações sobre o metabolismo individual do hospedeiro ou simbionte algal do perfil de metabólitos do holobionte pode levar a interpretações errôneas.
Por exemplo, até recentemente, acreditava-se que a presença de ácidos graxos poli-insaturados C18:3n-6, C18:4n-3 e C16 em extratos de tecidos de coral e holobionte era derivada do simbionte algal, pois os corais eram assumidos como não possuindo as desaturases ωx essenciais para a produção de ácidos graxos ômega-3 (ω3); no entanto, evidências genômicas recentes sugerem que múltiplos cnidários têm a capacidade de produzir PUFA ω3 de novo e biossintetizar PUFA ω3 de cadeia longa26. A combinação de GC-MS com marcação isotópica estável (por exemplo, 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) pode ser usada para rastrear o destino do carbono fotossinteticamente fixado através de redes metabólicas holobiont de coral sob condições de controle e em resposta a estressores externos27,28. No entanto, um passo crítico no rastreamento do destino de 13 C é a separação do tecido coral das células de algas – só então a presença de um composto marcado com 13C na fração hospedeira do coral pode ser inequivocamente atribuída como um metabólito derivado de Symbiodiniaceae translocado para o coral ou um produto a jusante de um composto marcado translocado. Essa técnica demonstrou seu poder ao desafiar a suposição de longa data de que o glicerol é a forma primária na qual a fotossíntese é translocada do simbionte para o hospedeiro29, bem como elucidar como o fluxo nutricional entre parceiros muda durante o clareamento27,28 e em resposta a espécies incompatíveis de Symbiodiniaceae11.
Embora a decisão de separar tecidos seja impulsionada principalmente pela questão de pesquisa, a praticidade, a confiabilidade e os potenciais impactos metabólicos dessa abordagem são importantes a serem considerados. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados e demonstrados para a extração de metabólitos do holobionte, bem como as frações separadas do hospedeiro e do simbionte. Nós comparamos os perfis de metabólitos do hospedeiro e simbionte independentemente e como esses perfis se comparam com o perfil de metabólitos holobiontes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A separação do hospedeiro e do simbionte é fácil e rapidamente alcançável através de centrifugação simples, e os resultados aqui mostram que a separação das frações pode fornecer informações valiosas indicativas de contribuições específicas dos membros do holobionte, o que pode contribuir para a análise funcional da saúde dos corais. Em corais adultos, a síntese lipídica é realizada primariamente pelo simbionte algal residente 40, que fornece lipídios (por exemplo, triacilgliceróis e fos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.M. foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Chanceler da UTS.
Materials
| 100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
| 2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
| 2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
| AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
| Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
| DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
| Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
| Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
| Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
| Primer | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
| tidyverse | v1.3.1 | R package | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
| TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |
References
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. , 211-229 (2022).
- Lawson, C. A., van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. , 179-202 (2022).
- LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
- Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
- Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
- Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
- Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
- Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
- Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
- Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
- González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
- Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
- Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
- Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
- Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
- Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
- Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
- Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
- Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
- Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
- Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
- Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
- Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
- Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
- Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
- Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
- Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
- Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
- Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
- Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
- Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
- Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
- Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
- Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
- Chen, W. -. N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
- Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
- Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
- Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
- Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
- Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
- Oakley, C., Davy, S., van Oppen, M., Lough, J. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. , 189-211 (2018).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
- Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
- Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).
