Aquí, presentamos la extracción y preparación de metabolitos polares y semipolares de un holobionte de coral, así como tejido huésped de coral separado y fracciones celulares de Symbiodiniaceae, para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas.
Los enfoques basados en cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) han demostrado ser poderosos para dilucidar la base metabólica de la simbiosis cnidario-dinoflagelada y cómo responde el coral al estrés (es decir, durante el blanqueamiento inducido por la temperatura). El perfil de metabolitos en estado estacionario del holobionte de coral, que comprende el huésped cnidario y sus microbios asociados (Symbiodiniaceae y otros protistas, bacterias, arqueas, hongos y virus), se ha aplicado con éxito en condiciones ambientales y de estrés para caracterizar el estado metabólico holístico del coral.
Sin embargo, para responder a las preguntas que rodean las interacciones simbióticas, es necesario analizar los perfiles de metabolitos del coral huésped y sus simbiontes de algas de forma independiente, lo que solo puede lograrse mediante la separación física y el aislamiento de los tejidos, seguidos de una extracción y análisis independientes. Si bien la aplicación de la metabolómica es relativamente nueva en el campo de los corales, los esfuerzos sostenidos de los grupos de investigación han dado como resultado el desarrollo de métodos robustos para analizar los metabolitos en los corales, incluida la separación del tejido huésped de coral y los simbiontes de algas.
Este artículo presenta una guía paso a paso para la separación de holobiontes y la extracción de metabolitos para el análisis de GC-MS, incluidos los pasos clave de optimización para su consideración. Demostramos cómo, una vez analizado de forma independiente, el perfil de metabolitos combinados de las dos fracciones (coral y Symbiodiniaceae) es similar al perfil del conjunto (holobionte), pero al separar los tejidos, también podemos obtener información clave sobre el metabolismo y las interacciones entre los dos socios que no se puede obtener del todo por sí solo.
Los metabolitos representan los productos finales de los procesos celulares, y la metabolómica -el estudio del conjunto de metabolitos producidos por un organismo o ecosistema determinado- puede proporcionar una medida directa del funcionamiento del organismo. Esto es particularmente crítico para explorar los ecosistemas, las interacciones simbióticas y las herramientas de restauración, ya que el objetivo de la mayoría de las estrategias de manejo es preservar (o restaurar) funciones específicas de los servicios ecosistémicos2. Los arrecifes de coral son un ecosistema acuático que demuestra el valor potencial de la metabolómica para dilucidar las interacciones simbióticas y vincular las respuestas fisiológicas de los corales con los impactos a nivel de la comunidad y del ecosistema3. La aplicación de la cromatografía de gases-espectrometría de masas de alto rendimiento (GC-MS) es especialmente valorada debido a su capacidad para analizar rápidamente una amplia gama de clases de metabolitos simultáneamente con alta selectividad y sensibilidad, proporcionar una rápida identificación de compuestos cuando se dispone de bibliotecas espectrales y proporcionar un alto nivel de reproducibilidad y precisión, con un coste por muestra relativamente bajo.
Los corales son holobiontes formados por el animal coralino, endosimbiontes dinoflagelados fotosintéticos (familia: Symbiodiniaceae4) y un microbioma complejo 5,6. En general, la aptitud del holobionte se mantiene principalmente a través del intercambio de pequeñas moléculas y elementos para apoyar el funcionamiento metabólico de cada miembro 7,8,9,10. Los enfoques metabolómicos han demostrado ser especialmente poderosos para dilucidar la base metabólica de la especificidad de la simbiosis 9,11, la respuesta de blanqueamiento al estrés térmico 7,8,12,13, las respuestas a enfermedades 14, las respuestas a la exposición a la contaminación 15, la fotoaclimatación 16 y la señalización química 17 en corales, así como para ayudar en el descubrimiento de biomarcadores 18,19. Además, la metabolómica puede proporcionar una valiosa confirmación de las conclusiones inferidas a partir de técnicas basadas en ADN y ARN 9,20. Por lo tanto, existe un potencial considerable para el uso de la metabolómica para evaluar la salud de los arrecifes y desarrollar herramientas para la conservación de los arrecifes3, por ejemplo, mediante la detección de biomarcadores metabólicos de estrés18,19 y para examinar el potencial de las estrategias de gestión activa, como los subsidios nutricionales21.
Separar las células huésped y simbionte y analizar sus perfiles de metabolitos de forma independiente, en lugar de juntas como el holobionte, puede proporcionar más información sobre las interacciones de la pareja, los estados fisiológicos y metabólicos independientes y los posibles mecanismos moleculares de adaptación 11,12,22,23,24. Sin separar el coral y las Symbiodiniaceae, es casi imposible dilucidar la contribución y el metabolismo de los corales y/o Symbiodiniaceae de forma independiente, excepto con la reconstrucción compleja del genoma y el modelado metabólico25, pero esto aún no se ha aplicado a la simbiosis coral-dinoflagelado. Además, intentar extraer información sobre el metabolismo individual del huésped o del simbionte de algas a partir del perfil de metabolitos del holobionte puede dar lugar a interpretaciones erróneas.
Por ejemplo, hasta hace poco, se pensaba que la presencia de ácidos grasos poliinsaturados C18:3n-6, C18:4n-3 y C16 en extractos de tejidos de corales y holobiontes se derivaba del simbionte de las algas, ya que se suponía que los corales no poseían las ωx desaturasas esenciales para la producción de ácidos grasos omega-3 (ω3); sin embargo, la evidencia genómica reciente sugiere que múltiples cnidarios tienen la capacidad de producir AGPI ω3 de novo y biosintetizar aún más AGPI26 de cadena larga ω3. La combinación de GC-MS con marcaje isotópico estable (p. ej., 13 C-bicarbonato, NaH 13CO 3) se puede utilizar para rastrear el destino del carbono fijado fotosintéticamente a través de las redes metabólicas de holobiontes de coral tanto en condiciones de control como en respuesta a factores estresantes externos27,28. Sin embargo, un paso crítico en el seguimiento del destino de 13 C es la separación del tejido de coral de las células de algas, solo entonces se puede asignar inequívocamente la presencia de un compuesto marcado con 13C en la fracción huésped del coral como un metabolito derivado de Symbiodiniaceae translocado al coral o un producto aguas abajo de un compuesto marcado translocado. Esta técnica ha demostrado su poder al desafiar la suposición sostenida durante mucho tiempo de que el glicerol es la forma primaria en la que el fotosintato se transloca del simbionte al huésped29, así como al dilucidar cómo cambia el flujo nutricional entre socios durante el blanqueamiento27,28 y en respuesta a especies de Symbiodiniaceae incompatibles11.
Si bien la decisión de separar los tejidos depende principalmente de la pregunta de investigación, es importante tener en cuenta la practicidad, la confiabilidad y los posibles impactos metabólicos de este enfoque. Aquí, proporcionamos métodos detallados y demostrados para la extracción de metabolitos del holobionte, así como de las fracciones separadas del huésped y del simbionte. Comparamos los perfiles de metabolitos del huésped y del simbionte de forma independiente y cómo se comparan estos perfiles con el perfil de metabolitos del holobionte.
La separación del huésped y el simbionte se puede lograr fácil y rápidamente a través de una simple centrifugación, y los resultados aquí muestran que la separación de las fracciones puede proporcionar información valiosa indicativa de contribuciones específicas de miembros holobiontes, que pueden contribuir al análisis funcional de la salud de los corales. En los corales adultos, la síntesis de lípidos es realizada principalmente por el simbionte de algas residente 40, que suministra lípidos (por …
The authors have nothing to disclose.
J.L.M. recibió el apoyo de una beca de investigación del rector de UTS.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |