Här presenterar vi extraktion och framställning av polära och halvpolära metaboliter från en korallholobiont, samt separerad korallvärdvävnad och Symbiodiniaceae-cellfraktioner, för gaskromatografi-masspektrometrianalys.
Gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)-baserade metoder har visat sig vara kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för nässel-dinoflagellatsymbiosen och hur koraller reagerar på stress (dvs. under temperaturinducerad blekning). Steady-state metabolitprofilering av korallholobionten, som omfattar nässelvärden och dess associerade mikrober (Symbiodiniaceae och andra protister, bakterier, arkéer, svampar och virus), har framgångsrikt tillämpats under omgivnings- och stressförhållanden för att karakterisera korallens holistiska metaboliska status.
Men för att svara på frågor kring de symbiotiska interaktionerna är det nödvändigt att analysera metabolitprofilerna för korallvärden och dess algsymbionter oberoende av varandra, vilket endast kan uppnås genom fysisk separation och isolering av vävnaderna, följt av oberoende extraktion och analys. Även om tillämpningen av metabolomik är relativt ny inom korallområdet, har forskargruppernas ihållande ansträngningar resulterat i utvecklingen av robusta metoder för att analysera metaboliter i koraller, inklusive separation av korallvärdvävnad och algsymbionter.
Detta dokument presenterar en steg-för-steg-guide för holobiontseparation och extraktion av metaboliter för GC-MS-analys, inklusive viktiga optimeringssteg för övervägande. Vi visar hur, när de analyserats oberoende av varandra, den kombinerade metabolitprofilen för de två fraktionerna (korall och Symbiodiniaceae) liknar profilen för helheten (holobiont), men genom att separera vävnaderna kan vi också få viktig information om metabolismen av och interaktionerna mellan de två partnerna som inte kan erhållas från helheten ensam.
Metaboliter representerar slutprodukterna av cellulära processer, och metabolomik – studiet av den uppsättning metaboliter som produceras av en viss organism eller ett visst ekosystem – kan ge ett direkt mått på organismens funktion1. Detta är särskilt viktigt för att utforska ekosystem, symbiotiska interaktioner och restaureringsverktyg, eftersom målet med de flesta förvaltningsstrategier är att bevara (eller återställa) specifika ekosystemtjänstfunktioner2. Korallrev är ett akvatisk ekosystem som visar det potentiella värdet av metabolomik för att belysa symbiotiska interaktioner och koppla korallers fysiologiska svar till påverkan på samhällsnivå och ekosystemnivå3. Tillämpningen av gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) med hög genomströmning är särskilt uppskattad på grund av dess förmåga att snabbt analysera ett brett spektrum av metabolitklasser samtidigt med hög selektivitet och känslighet, ge snabb föreningsidentifiering när spektralbibliotek finns tillgängliga och ge en hög nivå av reproducerbarhet och noggrannhet, med en relativt låg kostnad per prov.
Koraller är holobionter som består av koralldjuret, fotosyntetiska dinoflagellatendosymbionter (familj: Symbiodiniaceae4) och ett komplext mikrobiom 5,6. Sammantaget upprätthålls holobiontens kondition främst genom utbyte av små molekyler och element för att stödja den metaboliska funktionen hos varje medlem 7,8,9,10. Metabolomiska metoder har visat sig vara särskilt kraftfulla för att belysa den metaboliska grunden för symbiosspecificitet9,11, blekningsresponsen på termisk stress 7,8,12,13, sjukdomsrespons 14, föroreningsexponeringsrespons 15, fotoacklimatisering 16 och kemisk signalering17 i koraller, samt hjälpa till med upptäckt av biomarkörer 18,19. Dessutom kan metabolomik ge värdefull bekräftelse på de slutsatser som dras från DNA- och RNA-baserade tekniker 9,20. Det finns därför en betydande potential för användning av metabolomik för att bedöma revens hälsa och utveckla verktyg för bevarande av rev3, till exempel genom detektion av metabola biomarkörer för stress18,19 och för att undersöka potentialen hos aktiva förvaltningsstrategier såsom näringssubventioner21.
Att separera värd- och symbiontcellerna och analysera deras metabolitprofiler oberoende av varandra, snarare än tillsammans som holobionten, kan ge mer information om partnerinteraktioner, oberoende fysiologiska och metaboliska statusar och potentiella molekylära mekanismer för anpassning 11,12,22,23,24. Utan att separera korallen och Symbiodiniaceae är det nästan omöjligt att klarlägga korallens och/eller Symbiodiniaceaes bidrag och metabolism oberoende av varandra, förutom med komplex genomrekonstruktion och metabolisk modellering25, men detta har ännu inte tillämpats på korall-dinoflagellatsymbiosen. Att försöka extrahera information om värd- eller algsymbiontens individuella metabolism från holobioontens metabolitprofil kan dessutom leda till feltolkningar.
Till exempel, tills nyligen, trodde man att förekomsten av C18:3n-6, C18:4n-3 och C16 fleromättade fettsyror i extrakt från korall- och holobioontvävnader härrörde från algsymbionten, eftersom koraller antogs inte ha de ωx-desaturas som är nödvändiga för produktionen av omega-3 (ω3) fettsyror; Nya genomiska bevis tyder dock på att flera nässeldjur har förmågan att producera ω3 PUFA de novo och ytterligare biosyntetisera ω3 långkedjig PUFA26. Att kombinera GC-MS med stabil isotopmärkning (t.ex. 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) kan användas för att spåra ödet för fotosyntetiskt fixerat kol genom korallholobioontmetaboliska nätverk under både kontrollförhållanden och som svar på externa stressfaktorer27,28. Ett kritiskt steg i spårningen av 13 C-ödet är dock separationen av korallvävnaden från algcellerna – först då kan närvaron av en 13C-märkt förening i korallvärdfraktionen entydigt tilldelas som en Symbiodiniaceae-härledd metabolit translokerad till korallen eller en nedströmsprodukt av en translokerad märkt förening. Denna teknik har visat sin kraft genom att utmana det långvariga antagandet att glycerol är den primära formen i vilken fotosyntetat translokeras från symbiont till värd29, samt belysa hur näringsflödet mellan partners förändras under blekning27,28 och som svar på inkompatibla Symbiodiniaceae-arter11.
Även om beslutet att separera vävnader främst drivs av forskningsfrågan, är det viktigt att ta hänsyn till de praktiska, tillförlitliga och potentiella metaboliska effekterna av detta tillvägagångssätt. Här tillhandahåller vi detaljerade, demonstrerade metoder för extraktion av metaboliter från holobionten, såväl som de separata värd- och symbiontfraktionerna. Vi jämför metabolitprofilerna för värden och symbionten oberoende av varandra och hur dessa profiler förhåller sig till holobiont-metabolitprofilen.
Separationen av värd och symbiont är lätt och snabbt att uppnå via enkel centrifugering, och resultaten här visar att separering av fraktionerna kan ge värdefull information som indikerar specifika holobiontmedlemsbidrag, vilket kan bidra till den funktionella analysen av korallhälsa. I vuxna koraller utförs lipidsyntesen främst av den inhemska algsymbionten40, som levererar lipider (t.ex. triacylglycerol och fosfolipider)41 och fettsyror som kan främja stressåterhämtning <sup…
The authors have nothing to disclose.
J.L.M. stöddes av ett UTS Chancellor’s Research Fellowship.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |