Burada, gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi analizi için bir mercan holobiontundan polar ve yarı polar metabolitlerin yanı sıra ayrılmış mercan konakçı dokusu ve Symbiodiniaceae hücre fraksiyonlarının ekstraksiyonunu ve hazırlanmasını sunuyoruz.
Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) tabanlı yaklaşımların, cnidarian-dinoflagellat simbiyozunun metabolik temelini ve mercanın strese nasıl tepki verdiğini (yani, sıcaklığa bağlı ağartma sırasında) aydınlatmak için güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Cnidarian konakçısını ve onunla ilişkili mikropları (Symbiodiniaceae ve diğer protistler, bakteriler, arkeler, mantarlar ve virüsler) içeren mercan holobiontunun kararlı durum metabolit profili, mercanın bütünsel metabolik durumunu karakterize etmek için ortam ve stres koşulları altında başarıyla uygulanmıştır.
Bununla birlikte, simbiyotik etkileşimleri çevreleyen soruları cevaplamak için, mercan konakçısının ve alg simbiyontlarının metabolit profillerini bağımsız olarak analiz etmek gerekir, bu da yalnızca dokuların fiziksel olarak ayrılması ve izolasyonu ile elde edilebilir, ardından bağımsız ekstraksiyon ve analiz ile elde edilebilir. Metabolomiklerin uygulanması mercan alanı için nispeten yeni olsa da, araştırma gruplarının sürekli çabaları, mercan konakçı dokusunun ve alg simbiyontlarının ayrılması da dahil olmak üzere mercanlardaki metabolitleri analiz etmek için sağlam yöntemlerin geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır.
Bu makale, dikkate alınması gereken temel optimizasyon adımları da dahil olmak üzere, GC-MS analizi için holobiont ayrımı ve metabolitlerin ekstraksiyonu için adım adım bir kılavuz sunmaktadır. Bağımsız olarak analiz edildikten sonra, iki fraksiyonun (mercan ve Symbiodiniaceae) birleşik metabolit profilinin bütünün profiline (holobiont) nasıl benzer olduğunu gösteriyoruz, ancak dokuları ayırarak, iki ortağın metabolizması ve etkileşimleri hakkında tek başına bütünden elde edilemeyen önemli bilgiler de elde edebiliriz.
Metabolitler, hücresel süreçlerin son ürünlerini temsil eder ve metabolomikler – belirli bir organizma veya ekosistem tarafından üretilen metabolitler paketinin incelenmesi – organizma işleyişinin doğrudan bir ölçüsünü sağlayabilir1. Bu, ekosistemleri, simbiyotik etkileşimleri ve restorasyon araçlarını keşfetmek için özellikle kritiktir, çünkü çoğu yönetim stratejisinin amacı belirli ekosistem hizmet işlevlerini korumak (veya geri yüklemek)2. Mercan resifleri, simbiyotik etkileşimleri aydınlatmak ve mercan fizyolojik tepkilerini topluluk düzeyinde ve ekosistem düzeyinde etkilere bağlamak için metabolomiklerin potansiyel değerini gösteren bir su ekosistemidir3. Yüksek verimli gaz kromatografisi-kütle spektrometrisinin (GC-MS) uygulanması, yüksek seçicilik ve hassasiyetle aynı anda çok çeşitli metabolit sınıflarını hızlı bir şekilde analiz etme, spektral kitaplıklar mevcut olduğunda hızlı bileşik tanımlaması sağlama ve numune başına nispeten düşük bir maliyetle yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlama kapasitesi nedeniyle özellikle değerlidir.
Mercanlar, mercan hayvanı, fotosentetik dinoflagellat endosimbiyontlar (aile: Symbiodiniaceae4) ve karmaşık bir mikrobiyom 5,6’dan oluşan holobiontlardır. Genel olarak, holobiontun uygunluğu, öncelikle her bir üyeninmetabolik işleyişini desteklemek için küçük moleküllerin ve elementlerin değiş tokuşu yoluyla korunur 7,8,9,10. Metabolomik yaklaşımların, simbiyoz özgüllüğününmetabolik temelini aydınlatmak için özellikle güçlü olduğu kanıtlanmıştır 9,11, termal strese ağartma tepkisi 7,8,12,13, hastalık tepkileri 14, kirliliğe maruz kalma tepkileri 15, fotoiklimlendirme 16 ve kimyasal sinyalleşme 17 mercanlarda ve ayrıca biyobelirteç keşfine yardımcı olmak 18,19. Ek olarak, metabolomikler, DNA ve RNA tabanlı tekniklerdençıkarılan sonuçların değerli bir şekilde doğrulanmasını sağlayabilir 9,20. Bu nedenle, resif sağlığını değerlendirmek ve resiflerin korunması için araçlar geliştirmek için metabolomiklerinkullanımı için önemli bir potansiyel vardır 3, örneğin stresin metabolik biyobelirteçlerininsaptanması 18,19 ve beslenme sübvansiyonları gibi aktif yönetim stratejilerinin potansiyelini incelemek için21.
Konakçı ve simbiyont hücreleri ayırmak ve metabolit profillerini holobiont olarak birlikte değil, bağımsız olarak analiz etmek, partner etkileşimleri, bağımsız fizyolojik ve metabolik durumlar ve adaptasyon için potansiyel moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi verebilir 11,12,22,23,24. Mercan ve Symbiodiniaceae’yi ayırmadan, karmaşık genom rekonstrüksiyonu ve metabolik modelleme25 dışında, mercan ve/veya Symbiodiniaceae’nin katkısını ve metabolizmasını bağımsız olarak aydınlatmak neredeyse imkansızdır, ancak bu henüz mercan-dinoflagellat simbiyozuna uygulanmamıştır. Ayrıca, konakçının veya alg simbiyontunun bireysel metabolizması hakkında holobiontun metabolit profilinden bilgi çıkarmaya çalışmak yanlış yorumlamaya yol açabilir.
Örneğin, yakın zamana kadar, mercan ve holobiont dokularından elde edilen ekstraktlarda C18: 3n-6, C18: 4n-3 ve C16 çoklu doymamış yağ asitlerinin varlığının, mercanların omega-3 (ω3) yağ asitlerinin üretimi için gerekli olan ωx desatürazlara sahip olmadığı varsayıldığından, alg simbiyontundan türetildiği düşünülüyordu; bununla birlikte, son genomik kanıtlar, çoklu cnidarian’ın ω3 PUFA de novo üretme ve daha fazla biyosentez yapma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.3 uzun zincirli PUFA26. GC-MS’nin kararlı izotopik etiketleme (örneğin, 13 C-bikarbonat, NaH 13CO 3) ile birleştirilmesi, hem kontrol koşulları altında hem de dış stres faktörlerine yanıt olarak mercan holobiont metabolik ağları yoluyla fotosentetik olarak sabitlenmiş karbonun kaderini izlemek için kullanılabilir27,28. Bununla birlikte, 13 ° C’nin kaderinin izlenmesinde kritik bir adım, mercan dokusunun alg hücrelerinden ayrılmasıdır – ancak o zaman mercan konakçı fraksiyonunda 13C etiketli bir bileşiğin varlığı, mercana translokasyonlu bir Symbiodiniaceae türevi metabolit veya translokasyonlu etiketli bir bileşiğin aşağı akış ürünü olarak kesin olarak atanabilir. Bu teknik, gliserolün, fotosentezin ortakyaşamdan konakçıya29 yer değiştirdiği birincil form olduğu varsayımına meydan okuyarak ve ayrıca ağartma27,28 sırasında ve uyumsuz Symbiodiniaceae türlerine yanıt olarak eşler arası beslenme akışının nasıl değiştiğini açıklayarak gücünü göstermiştir11.
Dokuları ayırma kararı öncelikle araştırma sorusu tarafından yönlendirilirken, bu yaklaşımın pratikliği, güvenilirliği ve potansiyel metabolik etkilerinin dikkate alınması önemlidir. Burada, holobionttan metabolitlerin yanı sıra ayrı konakçı ve simbiyont fraksiyonlarından ekstraksiyonu için ayrıntılı, kanıtlanmış yöntemler sunuyoruz. Konak ve simbiyotun metabolit profillerini bağımsız olarak karşılaştırıyoruz ve bu profillerin holobiont metabolit profiliyle nasıl karşılaştırıldığını karşılaştırıyoruz.
Konakçı ve simbiyotun ayrılması, basit santrifüjleme yoluyla kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve buradaki sonuçlar, fraksiyonların ayrılmasının, mercan sağlığının fonksiyonel analizine katkıda bulunabilecek spesifik holobiont üye katkılarının göstergesi olan değerli bilgiler sağlayabileceğini göstermektedir. Yetişkin mercanlarda, lipid sentezi esas olarak lipitler (örneğin, triaçilgliserol ve fosfolipitler)41 ve stres iyileşmesini teşvik edebilen yağ asitleri<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., UTS Şansölyesi Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.
100% LC-grade methanol | Merck | 439193 | LC grade essential |
2 mL microcentrifuge tubes, PP | Eppendorf | 30121880 | Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes |
2030 Shimadzu gas chromatograph | Shimadzu | GC-2030 | |
710-1180 µm acid-washed glass beads | Merck | G1152 |
This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells |
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler | Shimadzu | AOC6000 | |
Bradford reagent | Merck | B6916 | Any protein colourimetric reagent is acceptable |
Compressed air gun | Ozito | 6270636 | Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical. |
DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness | Agilent | 122-5013 | |
DMF | Merck | RTC000098 | |
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine | Merck | 605514/ 600148 | Either or both internal standards can be added to the methanol. |
Flat bottom 96-well plate | Merck | CLS3614 | |
Glass scintillation vials | Merck | V7130 | 20 mL, with non-plastic seal |
Immunoglogin G | Merck | 56834 | if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable |
Primer | v4 | ||
R | v4.1.2 | ||
Shimadzu LabSolutions Insight software | v3.6 | ||
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | Pellets to make 1 M solution |
tidyverse | v1.3.1 | R package | |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | Or similar |
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
UV-96 well plate | Greiner | M3812 | |
Whirl-Pak sample bag | Merck | WPB01018WA | Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread |