Affinitetsrensing av et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus
Summary
Her presenterer vi en affinitetsrensingsmetode for et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus som er enkelt, billig og effektivt.
Abstract
Det fibrinolytiske enzymet fra Sipunculus nudus (sFE) er et nytt fibrinolytisk middel som både kan aktivere plasminogen til plasmin og nedbryte fibrin direkte, og viser store fordeler i forhold til tradisjonelle trombolytiske midler. På grunn av mangel på strukturell informasjon er imidlertid alle renseprogrammene for sFE basert på flertrinns kromatografirensinger, som er for kompliserte og kostbare. Her utvikles en affinitetsrensingsprotokoll for sFE for første gang basert på en krystallstruktur av sFE; Det inkluderer fremstilling av råprøven og lysin/arginin-agarose-matriseaffinitetskromatografikolonnen, affinitetsrensing og karakterisering av den rensede sFE. Etter denne protokollen kan en gruppe sFE renses innen 1 dag. Videre øker renheten og aktiviteten til den rensede sFE til henholdsvis 92% og 19,200 U / ml. Dermed er dette en enkel, billig og effektiv tilnærming for sFE-rensing. Utviklingen av denne protokollen er av stor betydning for videre bruk av sFE og andre lignende midler.
Introduction
Trombose er en stor trussel mot folkehelsen, spesielt etter den globale Covid-19-pandemien 1,2. Klinisk har mange plasminogenaktivatorer (PA), som vevstypeplasminogenaktivator (tPA) og urokinase (Storbritannia), blitt mye brukt som trombolytiske legemidler. PA kan aktivere pasientens plasminogen til aktiv plasmin for å nedbryte fibrin. Dermed er deres trombolytiske effektivitet sterkt begrenset av pasientenes plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiske midler, som metalloproteinaseplasmin og serinplasmin, er en annen type klinisk trombolytisk legemiddel som også inkluderer fibrinolytiske enzymer (FE) som plasmin, som kan oppløse blodpropper direkte, men raskt inaktiveres av forskjellige plasminhemmere5. Deretter har en ny type fibrinolytisk middel blitt rapportert som kan oppløse tromben ved ikke bare å aktivere plasminogenet til plasmin, men også nedbryte fibrin direkte 6-det fibrinolytiske enzymet fra den gamle peanøtormen Sipunculus nudus (sFE)6. Denne bifunksjonen gir sFE andre fordeler i forhold til tradisjonelle trombolytiske legemidler, spesielt når det gjelder unormal plasminogenstatus. Sammenlignet med andre bifunksjonelle fibrinolytiske midler 7,8,9, viser sFE flere fordeler, inkludert sikkerhet, over ikke-matavledede midler for legemiddelutvikling, spesielt for orale legemidler. Dette skyldes at biosikkerheten og biokompatibiliteten til Sipunculus nudus har vært godt etablert10.
I likhet med de andre naturlige fibrinolytiske midlene isolert fra mikroorganismer, regnormer og sopp, er rensingen av sFE fra S. nudus svært komplisert og inkluderer flere stadier, for eksempel vevshomogenisering, ammoniumsulfatutfelling, avsalting, anionbyttekromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og molekylsikt10,11,12. Et slikt rensesystem er ikke bare avhengig av dyktige ferdigheter og dyre materialer, men krever også flere dager for å fullføre hele prosedyren. Derfor er et enkelt renseprogram av sFE av stor betydning for videreutviklingen av sFE. Heldigvis to krystaller av sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) er oppnådd (se tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2). Gjennom strukturanalyse og molekylære dokkingeksperimenter fant vi at den katalytiske kjernen til sFE spesifikt kunne binde seg til mål som inneholder arginin- eller lysinrester.
Her ble det for første gang foreslått et affinitetsrensesystem, basert på krystallstrukturen til sFE. Ved å følge denne protokollen kunne svært ren og svært aktiv sFE renses fra råekstraktene i ett enkelt affinitetsrensetrinn. Protokollen utviklet her er ikke bare viktig for storskala forberedelse av sFE, men kan også brukes til rensing av andre fibrinolytiske midler.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av utilgjengeligheten av den eksakte gensekvensen av sFE, ble den for tiden brukte sFE ekstrahert fra fersk S. nudus14. Videre var renseprosedyrene for sFE rapportert i litteraturen kompliserte og kostbare, da de var basert på noen generelle trekk ved sFE, som molekylvekt, isoelektrisk punkt, ionstyrke og polaritet15,16. Ingen affinitetsrensingsprotokoll for sFE er rapportert til dags dato. I denne studien ble en affini…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) og Science and Technology Bureau of Fujian Province (nr. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
