Protokollet visar upprepade cerebrospinalvätske- och blodinsamlingar från epileptiska råttor utförda parallellt med kontinuerlig övervakning med videoelektroencefalogram (EEG). Dessa är avgörande för att utforska möjliga kopplingar mellan förändringar i olika kroppsvätskemolekyler och anfallsaktivitet.
Eftersom sammansättningen av kroppsvätskor återspeglar många fysiologiska och patologiska dynamiker, erhålls vanligtvis biologiska vätskeprover i många experimentella sammanhang för att mäta molekyler av intresse, såsom hormoner, tillväxtfaktorer, proteiner eller små icke-kodande RNA. Ett konkret exempel är provtagning av biologiska vätskor i forskningen om biomarkörer för epilepsi. I dessa studier är det önskvärt att jämföra molekylnivåerna i cerebrospinalvätska (CSF) och i plasma, genom att dra tillbaka CSF och plasma parallellt och beakta tidsavståndet för provtagningen från och till kramper. Den kombinerade CSF- och plasmaprovtagningen, i kombination med video-EEG-övervakning på epileptiska djur, är ett lovande tillvägagångssätt för validering av förmodade diagnostiska och prognostiska biomarkörer. Här beskrivs en procedur med kombinerad CSF-utsättning från cisterna magna och blodprovstagning från den laterala svansvenen hos epileptiska råttor som kontinuerligt video-EEG-övervakas. Denna procedur ger betydande fördelar jämfört med andra vanliga tekniker. Det möjliggör snabb provtagning med minimal smärta eller invasivitet och minskad anestesitid. Dessutom kan den användas för att erhålla CSF- och plasmaprover hos både tjudrade och telemetri-EEG-registrerade råttor, och den kan användas upprepade gånger under flera dagars experiment. Genom att minimera stressen på grund av provtagning genom att förkorta isoflurananestesi, förväntas mätningarna mer exakt återspegla de verkliga nivåerna av undersökta molekyler i biovätskor. Beroende på tillgången till en lämplig analytisk analys kan denna teknik användas för att mäta nivåerna av flera olika molekyler samtidigt som EEG-registrering utförs.
Cerebrospinalvätska (CSF) och blodprovstagning är viktiga för att identifiera och validera biomarkörer för epilepsi, i både preklinisk och klinisk forskning 1,2. Numera fokuserar diagnosen epilepsi och det mesta av forskningen om epilepsibiomarkörer på EEG och neuroimaging 3,4,5. Dessa metoder har dock flera begränsningar. Förutom rutinmässiga skalpmätningar kräver EEG i många fall invasiva tekniker som djupelektroder6. Hjärnavbildningsmetoder har dålig tids- och rumsupplösning och är relativt dyra och tidskrävande 7,8. Av denna anledning skulle identifiering av icke-invasiva, billiga och biofluidbaserade biomarkörer vara ett mycket attraktivt alternativ. Dessutom kan dessa biomarkörer kombineras med tillgängliga diagnostiska metoder för att skärpa deras prediktivitet.
Patienter som diagnostiserats med epilepsi genomgår rutinmässigt EEG 9,10 och blodprovstagning 11,12,13,14, och många även CSF-abstinens för att utesluta livshotande orsaker (t.ex. akuta infektioner, autoimmun encefalit)15. Dessa blod- och CSF-prover kan användas i klinisk forskning som syftar till att identifiera biomarkörer för epilepsi. Till exempel har Hogg och medarbetare funnit att en ökning av tre plasma-tRNA-fragment föregår anfallsförekomst vid human epilepsi14. På liknande sätt kan interleukin-1beta (IL-1β) nivåer i human cerebrospinalvätska och serum, uttryckt som förhållandet mellan IL-1β-nivåerna i cerebrospinalvätska och serum, förutsäga posttraumatisk epilepsiutveckling efter traumatisk hjärnskada16. Dessa studier belyser vikten av provtagning av biovätskor för forskning om biomarkörer för epilepsi, men de står inför flera begränsningar som är inneboende i kliniska prövningar, t.ex. den medgrundande faktorn för antiepileptiska läkemedel (AED) i blod, den frekventa bristen på etiologiinformation, otillräckliga kontroller, ett blygsamt antal patienter och andra17,18.
Preklinisk forskning erbjuder andra möjligheter att undersöka molekyler i biovätskor som potentiella biomarkörer för epilepsi. Faktum är att det är möjligt att ta plasma och/eller cerebrospinalvätska från djur samtidigt som EEG-registreringar utförs. Dessutom kan provtagning utföras upprepade gånger under flera dagar av experimentet, och ett antal ålders-, köns- och epileptiska förolämpningsmatchade kontroller kan användas för att förbättra studiens robusthet. Här beskrivs en flexibel teknik för att få fram cerebrospinalvätska från cisterna magna med parallell tillbakadragning av plasma från svansvenen hos EEG-övervakade råttor. Den presenterade tekniken har flera fördelar jämfört med alternativa metoder. Genom att använda fjärilsnål är det möjligt att samla in ryggmärgsvätska flera gånger utan att äventyra funktionen hos EEG-elektroder eller liknande huvudimplantat. Detta innebär en förfining av intratekala kateterutdragningsprocedurer, som är förknippade med en relativt hög infektionsrisk. Dessutom är den rapporterade metoden med fritt fall som används för blodinsamling överlägsen andra metoder för bloduttag i svansvenen på grund av den kraftigt minskade risken för hemolys, på grund av det faktum att blod inte passerar genom slangar och inget vakuumtryck appliceras. Om det utförs under strikt bakteriefria förhållanden är risken för infektion särskilt låg för djur. Genom att börja ta blodprov alldeles i slutet av djurens svans kan provtagningen dessutom upprepas flera gånger. Sådana tekniker är lätta att behärska och kan tillämpas i många prekliniska studier av sjukdomar i centrala nervsystemet.
Det aktuella arbetet illustrerar en teknik som är lätt att behärska för ryggmärgsvätska och blodinsamling hos råttor, vilket kan vara användbart inte bara för studier i modeller av epilepsi utan också av andra neurologiska tillstånd eller sjukdomar som Alzheimer, Parkinson eller multipel skleros. Inom epilepsiforskning är båda provtagningsprocedurerna i kombination med video-EEG idealiska när man försöker hitta en korrelation mellan nivåerna av olika lösliga molekyler och anfallsaktivitet. Av denna spec…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av ett bidrag från Europeiska unionens arbetsprogram för Horisont 2020 (ansökningsomgång H2020-FETOPEN-2018-2020) inom ramen för bidragsavtal 964712 (PRIME; till M. Simonato).
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |