Plattform för kvantitativ detektion av endometrieimmunceller baserad på immunhistokemi och digital bildanalys

Summary

Här utvecklades och validerades en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmuncellerna hos patienter med återkommande missfall i implantationsfönstret.

Abstract

För att utvärdera endometrieimmunmikromiljön hos patienter med återkommande missfall (RM) utvecklades och validerades en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller under midlutealfasen. Alla endometriumprover samlades in under mitten av lutealfasen av menstruationscykeln. Paraffinbäddade endometrievävnader snittades i 4 μm tjocka objektglas, och immunhistokemi (IHC) färgning utfördes för att detektera endometrieimmunceller, inklusive CD56+ uNK-celler, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ DCs och CD8+ T-celler. Panoramabilderna skannades med hjälp av en digital diabildsskanner och ett kommersiellt bildanalyssystem användes för kvantitativ analys. Andelen endometrieimmunceller beräknades genom att dividera antalet immunceller i det totala antalet endometrieceller. Med hjälp av det kommersiella bildanalyssystemet kan kvantitativ utvärdering av endometrieimmunceller, som är svåra eller omöjliga att analysera med konventionell bildanalys, enkelt och noggrant analyseras. Denna metodik kan användas för att kvantitativt karakterisera endometriums mikromiljö, inklusive interaktion mellan immunceller, och dess heterogenitet för olika patienter med reproduktiv svikt. Plattformen för kvantitativ utvärdering av endometrieimmunceller kan få viktig klinisk betydelse för diagnostik och behandling av RM-patienter.

Introduction

Återkommande missfall (RM) är förlusten av två eller flera på varandra följande graviditeter och är en komplex sjukdom som uppmärksammats av läkare under de senaste åren. Incidensen av RM hos kvinnor i fertil ålder är 1%-5% ¹. Resultat från tidigare studier visar att immunfaktorer är nära associerade med patogenesen av RM 2,3,4,5. Upprätthållande av immunhomeostas vid gränssnittet mellan moder och foster krävs för embryoimplantation och utveckling. Endometrieimmunceller utför flera reglerande roller för att upprätthålla denna homeostas, såsom att främja trofoblastinvasion, omforma spiralartärer och bidra till placentautveckling 6,7,8,9.

Avvikande endometrieimmunceller hos kvinnor med RM har tidigare rapporterats. Resultaten visar ett nära samband mellan den höga tätheten av naturliga mördarceller i livmodern (uNK) och förekomsten av RM^10,11,12. Ett ökat antal makrofager har rapporterats i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM, jämfört med de som fött¹³ barn levande. Regulatoriska T-celler (Treg) spelar en roll i moderns immuntolerans mot embryot, och deras nivå och funktion är nedsatt i decidua hos RM-patienter¹⁴. Cytotoxicitet T-celler (CTL) och dendritiska celler (DC) spelar också en roll i immunregleringen av graviditet^15,16. Därför kan en omfattande kvantitativ analys av lokala endometrieimmunceller under den mellersta lutealfasen bidra till att bättre förstå patogenesen av RM. Vissa nuvarande metoder för kvantitativ analys av endometrieimmunceller använder flödescytometri som exakt kan märka immunceller med flera markörer^17,18. Den kliniska tillämpningen av flödescytometri är dock begränsad eftersom den endast kan utföras på färsk vävnad. Att få färsk vävnad är endast möjligt när en stor volym av överskottstumör finns tillgänglig, en sällsynt händelse för endometrium. Immunhistokemi kan observera vävnadsmorfologi väl in situ och kan även märka olika immunceller, medan traditionella immunhistokemiska tekniker inte kan utföra kvantitativ analys av immunceller.

Jämfört med konventionella immunhistokemiska experiment har kvantitativ immunhistokemisk analys av immunceller i livmoderslemhinnan viktig klinisk betydelse. IHC-intensitetspoäng rankas vanligtvis på en fyrgradig skala eller stark och svag inom patologisk diagnostik och forskning 19,20,21. Denna semikvantitativa teknik är dock subjektiv, mycket felaktig och uppvisar betydande variabilitet inom och mellan observatörer²². En möjlig lösning är tillämpning av maskininlärning, vilket är värdefullt inom digital bildanalys^23,24. Genom att tillhandahålla kvantitativa mätningar möjliggör detta tillvägagångssätt en mer exakt bedömning av immuncellernas infiltration, distribution och densitet i livmodervävnaden. Denna kvantitativa information kan hjälpa till att belysa de dynamiska förändringarna i immuncellspopulationer under menstruationscykeln och vid olika patologiska tillstånd. Sammantaget ger förmågan att kvantitativt analysera immunceller i livmoderslemhinnan genom immunhistokemi värdefulla insikter i livmoderns immunmikromiljö.

Därför syftade protokollet till att utveckla och validera en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller inklusive uNK-celler, Tregs, makrofager, DCs och cytotoxiska T-celler under mid-lutealfasen hos RM-patienter.

Protocol

Forskningsinnehållet och protokollet har granskats etiskt och godkänts av den forskningsetiska kommittén vid Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Alla kvinnor (20-40 år) som deltog i studien gav informerat samtycke för provtagning och användning. 1. Förvärv av patologisk vävnad Förbered verktygen för vävnadsskörd, nämligen mätlinjal, pincett, inbäddningskassett, inbäddningspapper och vävnadskorg. Observera om mängden endometrievävnad (st…

Representative Results

För att utvärdera endometrieimmunceller kvantitativt och minska den instabilitet som orsakas av konstgjorda operativa misstag, etablerade vi en digital kvantitativ analysplattform för endometrieimmunceller genom att använda automatisk immunhistokemisk detektion och digitalt kvantitativt utvärderingssystem. Immunohistokemisk bildanalysplattform etablerades för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller hos patienter med återkommande missfall (RM) i implantationsfönstret. Alla vävnader i livmoderslemhinnan s…

Discussion

Detta protokoll etablerade en digital bildanalysplattform för immunhistokemi för att kvantitativt analysera endometrieimmunceller hos RM-patienter. Här upptäcktes sex endometrieimmunmarkörer för att utvärdera endometrieimmunmikromiljön hos RM-patienter.

Ett receptivt livmoderslemhinna under mitten av lutealfasen är nyckeln till framgångsrik implantation och graviditet^27,28. Därför spelar utvärdering av procentuella endomet…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200