腫瘍形成中の抗原特異的CD8+ T細胞の動態を評価するためのリンパ節転移モデル
Summary
ここで提示する実験デザインは、リンパ節(LN)転移中の抗原特異的CD8+ T細胞の研究に有用な生殖モデルを提供し、傍観者CD8+ T細胞の摂動を排除します。
Abstract
リンパ節を排出する腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞は、腫瘍形成中の抗腫瘍免疫応答のマウントにおいて重要性を増しています。しかし、多くの場合、がん細胞はリンパ節に転移性遺伝子座を形成してから、さらに遠隔臓器に転移します。局所的および系統的なCD8+ T細胞応答がLN転移によってどの程度影響を受けたかは不明のままである。この目的のために、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、糖タンパク質(GP)、およびクラスIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子H-2Dbによって提示されるGP由来ペプチドGP33-41に特異的なT細胞受容体(TCR)を有するP14トランスジェニックマウスに由来する代理ネオアンチゲンを発現するB16F10-GPメラノーマ細胞株と組み合わせたマウスLN転移モデルを設定しました。このプロトコルはLNの転移の間に抗原特定のCD8+ T細胞の応答の調査を可能にする。このプロトコルでは、C57BL/6JマウスにB16F10-GP細胞を皮下移植し、その後、ナイーブP14細胞を養子移植しました。皮下腫瘍が直径約5mmに成長した時点で、原発腫瘍を切除し、B16F10-GP細胞を腫瘍排譚リンパ節(TdLN)に直接注入しました。次に、LN転移の過程でCD8+ T細胞の動態をモニターした。まとめると、このモデルは、LN転移中の抗原特異的CD8+ T細胞免疫応答を正確に調査するためのアプローチを提供しました。
Introduction
がん免疫療法、特に免疫チェックポイント遮断(ICB)は、がん治療に革命をもたらしました1。ICBは、腫瘍微小環境(TME)の枯渇したCD8+ T細胞で高発現する共抑制性免疫受容体(PD-1、Tim-3、LAG-3、TIGITなど)を遮断し、枯渇したCD8+ T細胞の再活性化を引き起こします2。枯渇したCD8+ T細胞の不均一性を考慮すると、蓄積された証拠により、ドレナーギンパ節(dLN)を含む末梢に由来する腫瘍特異的CD8+ T細胞が、TMEには存在しないことが明らかになった3,4,5,6,7,8。最近、TdLN由来のTCF-1+TOX腫瘍特異的メモリーCD8+ T細胞(TdLN-TTSM)は、従来のメモリーT細胞のいくつかの機能的特性を具現化し、ICB治療によりさらに増殖し、子孫の疲弊細胞に分化できるICBの真のレスポンダーであることが確認されました9。全体として、これらの知見は、抗腫瘍免疫の獲得におけるLNの重要性を裏付けています。
リンパ節は、構造的基盤と生物学的シグナルを提供することにより、腫瘍特異的CD8+ T細胞のプライミングと活性化を促進する上で重要な場所として機能します10。数種類のがん細胞は、系統的な播種の前にセンチネルリンパ節(SLN、原発腫瘍を排出する最初のLN)に頻繁に播種する11。SLN転移の存在は、ヒトの癌の予後不良と関連しており、前臨床モデルでは、TdLNの腫瘍細胞がリンパ節のリンパ管と血管の両方を介して遠隔臓器に広がる可能性があることが示されました12,13,14,15。SLN生検は現在、多くの固形腫瘍タイプにおいて、その後の治療決定を導くための標準的な手順であり、関与していないLN16,17の不必要な切除を回避できる可能性がある。関与したLNでさえ、いくつかの研究により、局所LNの切除は、局所LN切除なしで放射線療法または全身療法を受けた患者と比較して全生存期間の改善を示さなかったことが実証されているため、外科的切除が必要かどうか、およびいつ必要かについては議論の余地があります18,19。1つの解釈は、顕微鏡的病変を伴う転移性LN(mLN)は、免疫細胞を教育する能力をある程度保持し、何らかの治療効果をもたらす可能性があるというものです。したがって、LN転移が抗腫瘍免疫応答、特にTdLN-TTSMの特性と機能にどのように影響するかを解明することは非常に重要です。
これまで、前臨床データと臨床データの両方で、mLN20の構造的および細胞的変化が明らかになりました。しかし、LN転移中の腫瘍特異的CD8+ T細胞の動的変化は説明されていません。したがって、さらなる調査のためには、LN転移の説得力のあるモデルを開発する必要があります。実際、いくつかの研究では、mLNマウスモデルがさまざまな方法で報告されています14,21,22。例えば、腋窩LNにおける自然転移は、4T1乳癌細胞の乳腺脂肪パッド22への移植を通じて行われた。別の研究では、Reticker-Flynnらは、解離したmLN組織から培養した腫瘍細胞の連続接種(9回)により、皮下原発腫瘍からLNへの転移の発生率が高い黒色腫細胞株を作製しました14。別の一般的に使用されるモデルは、フットパッドへの腫瘍細胞の注入によって調製され、転移性遺伝子座は膝窩LN22に形成されるであろう。特に、これらのモデルにおけるLN転移は必ずしも忠実であるとは限らないため、介入の正確な時点を評価することは困難である。
本研究では、B16F10細胞株のゲノムにLCMVウイルス糖タンパク質(GP)遺伝子配列をCRISPR/Cas9を介して挿入することにより、B16F10-GP細胞23,24の節内注入により、マウスLN転移モデルが確立されました9。次に、これらのマウスに、H-2Db GP33-41エピトープ25,26を特異的に認識するトランスジェニックT細胞受容体(TCR)を有するP14細胞を移植し、LN転移中の抗原特異的CD8+ T細胞の全身的および局所的動態を調べることができました。私たちの実験デザインは、免疫応答、特にバイスタンダーCD8+ T細胞の摂動を排除するLN転移中の抗原特異的CD8 + T細胞の研究に有用なモデルを提供します。これらの結果は、mLNを除去するか保持するかという臨床治療の選択肢に影響を与え、最大の治療効果を達成するためのmLNの操作に新たな光を当てるでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍形成の間、抗原提示細胞(APC)は腫瘍抗原を飲み込み、TdLNに移動してCD8+ T細胞をプライミングします。プライミングと活性化の後、CD8+ T細胞はTdLNを離れ、腫瘍に浸潤して腫瘍細胞を殺します10。リンパ器官からの免疫細胞の出口を遮断するTdLN切除とFTY720の投与を通じて、いくつかの研究がPD-1 / PD-L1チェックポイント療法の有効性を確保する上でTdLNの極め?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家科学基金会(第82122028位からLX)、中国国家自然科学基金会(第82173094位からLX)、重清自然科学基金会(第2023NSCQ-BHX0087から南西)の支援を受けました。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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