न्यूट्रलाइजेशन परख के माध्यम से SARS-CoV-2 के खिलाफ हास्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए एक आणविक उपकरण के रूप में छद्म टाइप वायरस
Summary
स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) प्रतिकृति-दोषपूर्ण विषाणु हैं जिनका उपयोग प्रामाणिक वायरस को संभालने की तुलना में सुरक्षित परिस्थितियों में होस्ट-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां प्रस्तुत एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जो दिखाता है कि COVID-2 टीकाकरण के बाद रोगियों के सीरम की बेअसर करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए SARS-CoV-19 PVs का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
Abstract
स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) आणविक उपकरण हैं जिनका उपयोग होस्ट-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सीरम नमूनों की बेअसर करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, इसके अलावा जीन थेरेपी में उनके बेहतर ज्ञात उपयोग के अलावा ब्याज की जीन की डिलीवरी के लिए। पीवी प्रतिकृति दोषपूर्ण हैं क्योंकि वायरल जीनोम को विभिन्न प्लास्मिड में विभाजित किया जाता है जो पीवी में शामिल नहीं होते हैं। यह सुरक्षित और बहुमुखी प्रणाली जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशालाओं में पीवी के उपयोग की अनुमति देती है। यहां, हम यहां बताए गए तीन प्लास्मिड के आधार पर लेंटिवायरल पीवी का उत्पादन करने के लिए एक सामान्य पद्धति प्रस्तुत करते हैं: (1) संक्रमण की निगरानी के लिए आवश्यक रिपोर्टर जीन को ले जाने वाली रीढ़ की प्लाज्मिड; (2) पीवी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक सभी संरचनात्मक प्रोटीन के लिए जीन ले जाने वाली पैकेजिंग प्लाज्मिड; (3) लिफाफा सतह ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति प्लास्मिड जो वायरस ट्रोपिज्म को निर्धारित करता है और मेजबान सेल में वायरल प्रविष्टि की मध्यस्थता करता है। इस काम में, SARS-CoV-2 स्पाइक गैर-प्रतिकृति SARS-CoV-2 छद्म टाइप लेंटिवायरस के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाने वाला लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन है।
संक्षेप में, पैकेजिंग कोशिकाओं (HEK293T) मानक तरीकों का उपयोग कर तीन अलग प्लास्मिड के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे. 48 घंटे के बाद, पीवी युक्त सतह पर तैरनेवाला काटा, फ़िल्टर्ड, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था. SARS-CoV-2 PVs की संक्रामकता का परीक्षण संक्रमण के बाद 48 घंटे की लक्ष्य सेल लाइन में रिपोर्टर जीन (लूसिफ़ेरेज़) की अभिव्यक्ति का अध्ययन करके किया गया था। सापेक्ष ल्यूमिनेसेंस इकाइयों (आरएलयू) के लिए मूल्य जितना अधिक होगा, संक्रमण/पारगमन दर उतनी ही अधिक होगी। इसके अलावा, संक्रामक पीवी को क्रमिक रूप से पतला सीरम नमूनों में जोड़ा गया था ताकि लक्ष्य कोशिकाओं में स्यूडोवायरस के प्रवेश की न्यूट्रलाइजेशन प्रक्रिया का अध्ययन किया जा सके, जिसे आरएलयू तीव्रता में कमी के रूप में मापा जाता है: उच्च न्यूट्रलाइजिंग गतिविधि के अनुरूप कम मूल्य।
Introduction
स्यूडोटाइप वायरस (पीवी) होस्ट-वायरस और रोगज़नक़-रोगज़नक़ इंटरैक्शन 1,2,3,4का अध्ययन करने के लिए माइक्रोबायोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले आणविक उपकरण हैं। पीवी में एक आंतरिक भाग होता है, वायरल कोर जो वायरल जीनोम की रक्षा करता है, और एक बाहरी भाग, वायरस की सतह पर लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन जो ट्रोपिज्म5 को परिभाषित करता है। एक स्यूडोवायरस लक्ष्य सेल में प्रतिकृति-अक्षम है क्योंकि इसमें नए वायरल कणों को उत्पन्न करने के लिए सभी आनुवंशिक जानकारी नहीं होती है। अजीबोगरीब विशेषताओं का यह संयोजन पीवी को वाइल्डटाइप वायरस का एक सुरक्षित विकल्प बनाता है। दूसरी ओर, वाइल्डटाइप वायरस अत्यधिक रोगजनक हैं और विश्लेषणके लिए बीएसएल 2 प्रयोगशालाओं में उपयोग नहीं किए जा सकते हैं।
पीवी की संक्रामकता की निगरानी एक रिपोर्टर जीन द्वारा की जा सकती है, आमतौर पर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी, आरएफपी, वाईएफपी) या एक एंजाइम के लिए कोडिंग जो केमिलुमिनसेंट उत्पादों (लूसिफ़ेरेज़) का उत्पादन करता है। यह पीवी उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड में से एक में निहित है और स्यूडोवायरस7 के जीनोम में शामिल है।
वर्तमान में कई प्रकार के पीवी कोर मौजूद हैं, जिनमें एचआईवी -1 जीनोम पर आधारित लेंटिवायरल-व्युत्पन्न कण शामिल हैं। अन्य प्लेटफार्मों पर एचआईवी-1-आधारित पीवी का महान लाभ लक्ष्य सेल जीनोम8 में उनकी आंतरिक एकीकरण प्रक्रिया है। हालांकि एचआईवी -1 एक अत्यधिक संक्रामक वायरस है और एड्स का प्रेरक एजेंट है, ये लेंटिवायरल वैक्टर वर्षों से व्यापक अनुकूलन चरणों के कारण उपयोग करने के लिए सुरक्षित हैं। इष्टतम सुरक्षा की स्थिति 2एनडी-पीढ़ी लेंटिवायरल वैक्टर की शुरूआत के साथ हासिल की गई थी, जिसमें वायरल जीन ट्रांसडक्शन क्षमताओं को प्रभावित किए बिना समाप्त हो गए थे9. 3और 4वीं पीढ़ियों अलग प्लास्मिड10,11 में वायरल जीनोम के आगे विभाजन के साथ lentiviral वेक्टर हैंडलिंग की वृद्धि हुई सुरक्षा में योगदान दिया. पीवी की नवीनतम पीढ़ियों को आमतौर पर जीन थेरेपी के लिए लेंटिवायरल वैक्टर का उत्पादन करने के लिए नियोजित किया जाता है।
पीवी का उपयोग उत्पादन और संक्रमण चरणों दोनों के दौरान वायरस और मेजबान कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। पीवी विशेष रूप से स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन परख (पीवीएनए) में कार्यरत हैं। PVNAs व्यापक रूप से PV लिफाफा12,13 पर वायरल ग्लाइकोप्रोटीन को लक्षित करके सीरम या प्लाज्मा के बेअसर क्षमता का आकलन करने के लिए मान्य हैं. निरोधात्मक एकाग्रता 50 (IC50) के रूप में व्यक्त की गई न्यूट्रलाइजेशन गतिविधि को सीरम / प्लाज्मा के कमजोर पड़ने के रूप में परिभाषित किया गया है जो वायरल कण प्रविष्टि14 के 50% को अवरुद्ध करता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने बूस्टर वैक्सीन खुराक प्राप्त करने से पहले और बाद में एकत्र किए गए सीरा में गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम – कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) के खिलाफ एंटीबॉडी गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एक PVNA के सेट-अप का वर्णन किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि एक वाइल्डटाइप वायरस का उपयोग वास्तविक संक्रमण का अनुकरण करता है, लेंटिवायरल पीवी रोगजनक वायरस 4,20,21के साथ काम करने के लिए आवश्यक सख्त सुरक्षा आवश्यकताओं के ब?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम स्वास्थ्य देखभाल कार्यकर्ताओं, स्वयंसेवकों के योगदान को स्वीकार करते हैं। इस परियोजना को उत्कृष्टता विभाग 2023/2027, एमयूआर, इटली द्वारा समर्थित किया गया था। एआर और डीजेड को PRIN2022 (ईयू फंडिंग; नेक्स्टजेनरेशनईयू)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
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