Détermination de l’activité procoagulante de la vésicule extracellulaire (EV) à l’aide du temps de coagulation activé par EV (EV-ACT)

Résumé

Ce protocole étudie l’utilisation d’un plasma riche en vésicules extracellulaires (VE) comme indicateur de la capacité de coagulation de l’EV. Le plasma riche en VE est obtenu par un processus de centrifugation différentielle et de recalcification ultérieure.

Résumé

Le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans diverses maladies fait l’objet d’une attention accrue, notamment en raison de leur puissante activité procoagulante. Cependant, il y a un besoin urgent d’un test au chevet du patient pour évaluer l’activité procoagulante de la VE en milieu clinique. Cette étude propose l’utilisation du temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE comme mesure de l’activité procoagulante des VE. Des procédures normalisées ont été utilisées pour obtenir du sang total contenant du sodium et du sang total, suivies d’une centrifugation différentielle pour obtenir du plasma riche en VE. Le plasma riche en VE et le chlorure de calcium ont été ajoutés à la coupelle d’essai, et les changements de viscoélasticité ont été surveillés en temps réel à l’aide d’un analyseur. Le temps de coagulation naturel du plasma riche en VE, APPELÉ EV-ACT, a été déterminé. Les résultats ont révélé une augmentation significative de l’EV-ACT lorsque l’EV a été retiré du plasma obtenu à partir de volontaires sains, tandis qu’elle a considérablement diminué lorsque l’EV a été enrichie. De plus, l’EV-ACT a été considérablement raccourci dans les échantillons humains de prééclampsie, de fracture de la hanche et de cancer du poumon, ce qui indique des niveaux élevés d’EV plasmatique et une promotion de l’hypercoagulation sanguine. Grâce à sa procédure simple et rapide, EV-ACT est prometteur en tant que test de chevet pour évaluer la fonction de coagulation chez les patients présentant des taux plasmatiques élevés d’EV.

Introduction

La thrombose, qui est causée par l’hypercoagulabilité, joue un rôle important dans diverses maladies, notamment les traumatismes cérébraux¹, la pré-éclampsie², les tumeurs³ et les patients fracturés⁴. Le mécanisme sous-jacent à l’hypercoagulabilité est complexe, et l’accent a récemment été mis sur le rôle des vésicules extracellulaires (VE) dans les troubles de la coagulation. Les VE sont des corps en forme de vésicule avec une structure bicouche qui se détache de la membrane cellulaire, dont le diamètre varie de 10 nm à 1000 nm. Ils sont associés à divers processus patholo....

Protocole

La collecte d’échantillons humains a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’hôpital général de l’Université médicale de Tianjin. La collecte de sang veineux humain a strictement suivi les directives émises par la Commission nationale de la santé de Chine, à savoir WS/T 661-2020 Directive pour la collecte d’échantillons de sang veineux. Brièvement, du sang a été prélevé sur des personnes en bonne santé avec le consentement éclairé de la veine brachiale antérieure, et les échantillons ont été mélangés à l’aide d’un anticoagulant à 3,2% de citrate de sodium dans un rapport de 1 :9. Lorsque seuls des échantillons d’anticoagulant à base de citrate de sodium on....

Résultats

Le temps d’activation de la thrombine du plasma riche en VE a été mesuré à l’aide d’un analyseur viscoélastique pour la mesure du temps de coagulation plasmatique. La machine se compose de quatre composants principaux : un convertisseur de signal électronique, une sonde, un réservoir de détection et un élément chauffant (Figure 1A,B). La sonde utilise des oscillations à haute fréquence et à faible amplitude pour détecter les changements de viscosité du plasma. Le contrôle de.......

Discussion

Dans cette étude, la préparation de plasma riche en VE a été décrite, et la rationalité de la méthode a été vérifiée à l’aide de la cytométrie en flux. Par la suite, les échantillons de plasma recalcifié ont été analysés pour le temps d’ACT à l’aide d’un analyseur de caillots basé sur les principes de viscoélasticité²⁴. Comme le montre la figure 3A, on a constaté que la concentration de VE obtenue par ultracentrifugation raccourcissait le temps d’EV-ACT, tandis que le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Particules fluorescentes AccuCount Ultra Rainbow	3,8 microm ; Spherotech, Lake Forest, IL, États-Unis		Pour la détection quantitative du
chlorure de calcium	Werfen (Chine 0020006800		20 mM
Century Caillot	analyzer Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		Le principe est de mesurer la viscosité du plasma par méthode viscoélastique
Sonde jetable et gobelet de test	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
Cytomètre en flux LSR Fortessa	BD, USA		Utilisé pour détecter les
billes de polystyrène	Megamix Biocytex, Marseille, France	7801	Le Megamix se compose d’un mélange de microbilles de diamètres sélectionnés : 0,5 & micro ; m, 0,9 et micro ; m et 3 µ ;m.

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