Detta protokoll undersöker användningen av extracellulär vesikelrik (EV)-rik plasma som en indikator på den koagulativa förmågan hos EV. EV-rik plasma erhålls genom en process med differentiell centrifugering och efterföljande rekalkifiering.
Extracellulära vesiklars (EV) roll i olika sjukdomar får ökad uppmärksamhet, särskilt på grund av deras potenta prokoagulerande aktivitet. Det finns dock ett akut behov av ett bedside-test för att bedöma prokoaguleringsaktiviteten hos EV i kliniska miljöer. Denna studie föreslår användning av trombinaktiveringstid för EV-rik plasma som ett mått på EV:s prokoagulerande aktivitet. Standardiserade procedurer användes för att erhålla natriumciterat helblod, följt av differentiell centrifugering för att erhålla EV-rik plasma. Den EV-rika plasman och kalciumkloriden tillsattes i testkoppen, och förändringarna i viskoelasticitet övervakades i realtid med hjälp av en analysator. Den naturliga koagulationstiden för EV-rik plasma, kallad EV-ACT, bestämdes. Resultaten visade en signifikant ökning av EV-ACT när EV avlägsnades från plasma från friska frivilliga, medan den minskade signifikant när EV anrikades. Dessutom var EV-ACT avsevärt förkortat i humana prover från havandeskapsförgiftning, höftfraktur och lungcancer, vilket indikerar förhöjda nivåer av plasma-EV och främjande av hyperkoagulation i blodet. Med sin enkla och snabba procedur är EV-ACT lovande som ett patientnära test för att utvärdera koagulationsfunktionen hos patienter med höga plasma-EV-nivåer.
Trombos, som orsakas av hyperkoagulabilitet, spelar en viktig roll i olika sjukdomar, inklusive hjärntrauma1, havandeskapsförgiftning2, tumörer3 och frakturpatienter4. Mekanismen bakom hyperkoagulerbarhet är komplex, och på senare tid har tonvikten lagts på extracellulära vesiklars (EV) roll vid koagulationsrubbningar. EV är vesikelliknande kroppar med en tvåskiktsstruktur som lossnar från cellmembranet, med en diameter på mellan 10 nm och 1000 nm. De är förknippade med en mängd olika sjukdomsprocesser, särskilt koagulationsrubbningar5. Flera studier har identifierat EV som en lovande prediktor för trombosrisk 6,7. Den prokoagulerande aktiviteten hos EV beror på uttrycket av koagulationsfaktorer, främst vävnadsfaktor (TF) och fosfatidylserin (PS). EV med robust prokoaguleringsaktivitet förbättrar signifikant den katalytiska effektiviteten hos tenas och protrombinkomplex, vilket främjar trombinmedierad fibrinogen och lokal trombos8. Förhöjda nivåer av EV och deras orsakssamband med hyperkoagulabilitet har observerats vid många sjukdomar9. Följaktligen är standardisering av detektering av elfordon och rapportering av deras prokoaguleringsaktivitet ett viktigt undersökningsområde10.
Hittills finns endast ett fåtal kommersiella kit tillgängliga för att upptäcka elbilars prokoaguleringsaktivitet. MP-Activity-analysen och MP-TF-analysen, som produceras av ett kommersiellt företag, är funktionella analyser som används för att mäta EV:s prokoaguleringsaktivitet i plasma11. Dessa analyser använder en princip som liknar den för enzymkopplade immunadsorberande analyser för att detektera PS och TF på EV. Dessa kit är dock dyra och begränsade till ett fåtal forskningsinstitutioner på hög nivå. Processen är komplex och tidskrävande, vilket gör det utmanande att implementera dem i kliniska miljöer. Dessutom blandar en kommersiellt utvecklad prokoagulerande fosfolipidanalys (PPL) PS-fri plasma med testplasma och mäter koagulationstiden för att kvantitativt detektera nivåer av PS-positiva EV12. Dessa analyser fokuserar dock främst på PS och TF på elfordon, och förbiser andra koagulationsvägar som cirkulerande elfordon kan varainvolverade i.
Plasmakoagulationssystemet är invecklat och består av både “osynliga” och “synliga” komponenter, inklusive koagulantia, antikoagulantia, fibrinolytiska system och EV suspenderade i plasma. Fysiologiskt upprätthåller dessa komponenter en dynamisk balans. Vid patologiska tillstånd bidrar signifikant ökade EV i cirkulationen till hyperkoagulabilitet, särskilt hos patienter med hjärntrauma, havandeskapsförgiftning, frakturer och olika typer av cancer13. För närvarande innebär utvärderingen av koagulationsstatus i kliniska laboratorier främst att bedöma koagulationssystemet, antikoagulationssystemet och fibrinolysen 14,15,16,17. Protrombintid, aktiverad partiell tromboplastintid, trombintid och internationellt normaliserat förhållande används ofta för att utvärdera koagulationsfaktornivåer i koagulationssystemet18. Nyligen genomförda studier har dock visat att dessa tester inte fullt ut återspeglar hyperkoagulerbarheten hos vissa sjukdomar19. Andra analysmetoder, såsom tromboelastometri (TEG), rotations-TEG och Sonoklot-analys, mäter viskoelastiska förändringar i helblod20,21. Eftersom helblodsprover innehåller många blodkroppar och blodplättar, är det mer sannolikt att dessa tester indikerar koagulationsstatusen för provet som helhet. Vissa forskare har rapporterat om blodkropparnas och blodplättarnas roll i prokoaguleringsaktiviteten22,23. En nyligen genomförd studie upptäckte också att tidigare koagulationsfunktionstester har svårt att upptäcka förändringar i mikropartiklarnas prokoaguleringsaktivitet24. Därför har en hypotes föreslagits att den prokoagulerande funktionen hos EV kan utvärderas genom viskoelastiska mätningar av den aktiverade koagulationstiden (ACT) i EV-rik plasma.
I denna studie beskrevs framställningen av EV-rik plasma, och metodens rationalitet verifierades med hjälp av flödescytometri. Därefter analyserades de rekalkifierade plasmaproverna med avseende på ACT-tid med hjälp av en koagelanalysator baserad på viskoelasticitetsprinciper24. Som visas i figur 3A visade sig koncentrationen av EV som erhölls genom ultracentrifugering förkorta EV-ACT-tiden, medan supernatanten efter ultracentrifugering, som hade reducerade E…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av anslag från National Natural Science Foundation of China, anslag nr 81930031, 81901525. Dessutom tackar vi Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. för att ha försett oss med maskiner och teknisk vägledning.
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |