Summary

Bestämning av den prokoagulerande aktiviteten hos extracellulär vesikel (EV) med hjälp av EV-aktiverad koagulationstid (EV-ACT)

Published: August 04, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll undersöker användningen av extracellulär vesikelrik (EV)-rik plasma som en indikator på den koagulativa förmågan hos EV. EV-rik plasma erhålls genom en process med differentiell centrifugering och efterföljande rekalkifiering.

Abstract

Extracellulära vesiklars (EV) roll i olika sjukdomar får ökad uppmärksamhet, särskilt på grund av deras potenta prokoagulerande aktivitet. Det finns dock ett akut behov av ett bedside-test för att bedöma prokoaguleringsaktiviteten hos EV i kliniska miljöer. Denna studie föreslår användning av trombinaktiveringstid för EV-rik plasma som ett mått på EV:s prokoagulerande aktivitet. Standardiserade procedurer användes för att erhålla natriumciterat helblod, följt av differentiell centrifugering för att erhålla EV-rik plasma. Den EV-rika plasman och kalciumkloriden tillsattes i testkoppen, och förändringarna i viskoelasticitet övervakades i realtid med hjälp av en analysator. Den naturliga koagulationstiden för EV-rik plasma, kallad EV-ACT, bestämdes. Resultaten visade en signifikant ökning av EV-ACT när EV avlägsnades från plasma från friska frivilliga, medan den minskade signifikant när EV anrikades. Dessutom var EV-ACT avsevärt förkortat i humana prover från havandeskapsförgiftning, höftfraktur och lungcancer, vilket indikerar förhöjda nivåer av plasma-EV och främjande av hyperkoagulation i blodet. Med sin enkla och snabba procedur är EV-ACT lovande som ett patientnära test för att utvärdera koagulationsfunktionen hos patienter med höga plasma-EV-nivåer.

Introduction

Trombos, som orsakas av hyperkoagulabilitet, spelar en viktig roll i olika sjukdomar, inklusive hjärntrauma1, havandeskapsförgiftning2, tumörer3 och frakturpatienter4. Mekanismen bakom hyperkoagulerbarhet är komplex, och på senare tid har tonvikten lagts på extracellulära vesiklars (EV) roll vid koagulationsrubbningar. EV är vesikelliknande kroppar med en tvåskiktsstruktur som lossnar från cellmembranet, med en diameter på mellan 10 nm och 1000 nm. De är förknippade med en mängd olika sjukdomsprocesser, särskilt koagulationsrubbningar5. Flera studier har identifierat EV som en lovande prediktor för trombosrisk 6,7. Den prokoagulerande aktiviteten hos EV beror på uttrycket av koagulationsfaktorer, främst vävnadsfaktor (TF) och fosfatidylserin (PS). EV med robust prokoaguleringsaktivitet förbättrar signifikant den katalytiska effektiviteten hos tenas och protrombinkomplex, vilket främjar trombinmedierad fibrinogen och lokal trombos8. Förhöjda nivåer av EV och deras orsakssamband med hyperkoagulabilitet har observerats vid många sjukdomar9. Följaktligen är standardisering av detektering av elfordon och rapportering av deras prokoaguleringsaktivitet ett viktigt undersökningsområde10.

Hittills finns endast ett fåtal kommersiella kit tillgängliga för att upptäcka elbilars prokoaguleringsaktivitet. MP-Activity-analysen och MP-TF-analysen, som produceras av ett kommersiellt företag, är funktionella analyser som används för att mäta EV:s prokoaguleringsaktivitet i plasma11. Dessa analyser använder en princip som liknar den för enzymkopplade immunadsorberande analyser för att detektera PS och TF på EV. Dessa kit är dock dyra och begränsade till ett fåtal forskningsinstitutioner på hög nivå. Processen är komplex och tidskrävande, vilket gör det utmanande att implementera dem i kliniska miljöer. Dessutom blandar en kommersiellt utvecklad prokoagulerande fosfolipidanalys (PPL) PS-fri plasma med testplasma och mäter koagulationstiden för att kvantitativt detektera nivåer av PS-positiva EV12. Dessa analyser fokuserar dock främst på PS och TF på elfordon, och förbiser andra koagulationsvägar som cirkulerande elfordon kan varainvolverade i.

Plasmakoagulationssystemet är invecklat och består av både “osynliga” och “synliga” komponenter, inklusive koagulantia, antikoagulantia, fibrinolytiska system och EV suspenderade i plasma. Fysiologiskt upprätthåller dessa komponenter en dynamisk balans. Vid patologiska tillstånd bidrar signifikant ökade EV i cirkulationen till hyperkoagulabilitet, särskilt hos patienter med hjärntrauma, havandeskapsförgiftning, frakturer och olika typer av cancer13. För närvarande innebär utvärderingen av koagulationsstatus i kliniska laboratorier främst att bedöma koagulationssystemet, antikoagulationssystemet och fibrinolysen 14,15,16,17. Protrombintid, aktiverad partiell tromboplastintid, trombintid och internationellt normaliserat förhållande används ofta för att utvärdera koagulationsfaktornivåer i koagulationssystemet18. Nyligen genomförda studier har dock visat att dessa tester inte fullt ut återspeglar hyperkoagulerbarheten hos vissa sjukdomar19. Andra analysmetoder, såsom tromboelastometri (TEG), rotations-TEG och Sonoklot-analys, mäter viskoelastiska förändringar i helblod20,21. Eftersom helblodsprover innehåller många blodkroppar och blodplättar, är det mer sannolikt att dessa tester indikerar koagulationsstatusen för provet som helhet. Vissa forskare har rapporterat om blodkropparnas och blodplättarnas roll i prokoaguleringsaktiviteten22,23. En nyligen genomförd studie upptäckte också att tidigare koagulationsfunktionstester har svårt att upptäcka förändringar i mikropartiklarnas prokoaguleringsaktivitet24. Därför har en hypotes föreslagits att den prokoagulerande funktionen hos EV kan utvärderas genom viskoelastiska mätningar av den aktiverade koagulationstiden (ACT) i EV-rik plasma.

Protocol

Insamlingen av mänskliga prover godkändes av den medicinska etikkommittén vid Tianjin Medical University General Hospital. Insamlingen av humant venöst blod följde strikt de riktlinjer som utfärdats av Kinas nationella hälsokommission, nämligen WS/T 661-2020 Riktlinje för insamling av venösa blodprover. Kortfattat samlades blod in från friska individer med informerat samtycke från den främre brachialvenen, och proverna blandades med 3,2 % natriumcitratantikoagulantia i förhållandet 1:9. När endast prover …

Representative Results

Trombinaktiveringstiden för EV-rik plasma mättes med hjälp av en viskoelastisk metodanalysator för mätning av plasmakoagulationstid. Maskinen består av fyra huvudkomponenter: en elektronisk signalomvandlare, en sond, en detekteringstank och ett värmeelement (Figur 1A,B). Sonden använder högfrekventa svängningar med låg amplitud för att detektera förändringar i plasmaviskositeten. Daglig kvalitetskontroll omfattar i första hand luftkvalitetskontroll för att be…

Discussion

I denna studie beskrevs framställningen av EV-rik plasma, och metodens rationalitet verifierades med hjälp av flödescytometri. Därefter analyserades de rekalkifierade plasmaproverna med avseende på ACT-tid med hjälp av en koagelanalysator baserad på viskoelasticitetsprinciper24. Som visas i figur 3A visade sig koncentrationen av EV som erhölls genom ultracentrifugering förkorta EV-ACT-tiden, medan supernatanten efter ultracentrifugering, som hade reducerade E…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av anslag från National Natural Science Foundation of China, anslag nr 81930031, 81901525. Dessutom tackar vi Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. för att ha försett oss med maskiner och teknisk vägledning.

Materials

AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA For quantitative detection of MP
Calcium chloride Werfen (china) 0020006800 20 mM
Century Clot analyzer Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer BD, USA Used to detect MP
Megamix polystyrene beads Biocytex, Marseille, France 7801 The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.

References

  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Play Video

Citer Cet Article
Gao, Y., Li, K., Qin, Q., Zhang, J., Liu, L. Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT). J. Vis. Exp. (198), e65661, doi:10.3791/65661 (2023).

View Video