Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi
Summary
Burada, PINK1B9-null mutant meyve sineklerinde biyoenerjetik analiz etmek için yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolü sunuyoruz. Yöntem, Substrat-Bağlayıcı-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolünü kullanır.
Abstract
Parkinson Hastalığı (PH) dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi hücresel bozukluklar, mitokondriyal fonksiyonların bozulmasıyla enerji metabolizmasını bozan bozukluklardan bazılarıdır. Mitokondri, hem enerji metabolizmasını hem de hücre sağkalımı ve ölümünde yer alan hücresel süreçleri kontrol eden organellerdir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirme yaklaşımları, patolojik ve fizyolojik süreçlerdeki hücresel durumlar hakkında önemli bilgiler sunabilir. Bu bağlamda, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca, mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak, Drosophila melanogaster gibi genetik ve deneysel olarak izlenebilir modeller gerektirir.
Bu model, insan fizyolojisine benzerliği, hızlı yaşam döngüsü, kolay bakımı, maliyet etkinliği, yüksek verim yetenekleri ve en aza indirilmiş sayıda etik kaygı gibi çeşitli avantajlar sunar. Bu özellikler toplu olarak onu karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç olarak kurar. Bu çalışma, Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutantı kullanılarak mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır. Pink1 geni, işlevsiz mitokondrinin mitokondriyal ağdan çıkarılması için çok önemli olan mitofaji olarak tanınan bir süreç yoluyla PTEN’in neden olduğu varsayılan kinaz 1’i kodlamaktan sorumludur. Bu gendeki mutasyonlar, otozomal resesif erken başlangıçlı ailesel PH formu ile ilişkilendirilmiştir. Bu model, PH’nin patofizyolojisinde yer alan mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Mitokondri, apoptotik regülasyon, kalsiyum homeostazı ve biyosentetik yollara katılım dahil olmak üzere önemli işlevleri kontrol eden hücresel organellerdir. Özerk genetik materyale sahip olarak, hücresel bakım ve onarım süreçlerine katkıda bulunabilirler. Yapıları, her ikisi de hücresel enerji 1,2,3 için çok önemli olan elektron taşıma zincirini ve oksidatif fosforilasyonu barındırır. Özellikle, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS)2 yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretimi yoluyla enerji kontrolü sağlanır. Mitokondriyal fonksiyonların bozulması ile enerji metabolizmasının bozulması hem hücre sağkalımında hem de ölümde meydana gelir 4,5, sıklıkla kanser gibi çok çeşitli insan patolojileri ve Parkinson Hastalığı (PD) gibi nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir3,6.
PH kronik, ilerleyici ve nörolojik bir hastalıktır. Bu hastalığın birincil nedeni, özellikle 6,7,8 hareketini kontrol eden nörotransmitter dopaminin üretiminden sorumlu olan substantia nigra’da beyin hücrelerinin ölümüdür. Parkinsonizmi mitokondriyal disfonksiyona bağlayan en eski gözlem, 1988’de solunum zinciri Kompleksi I9’u inhibe eden toksinler kullanılarak deneysel modellerde yapıldı.
Şu anda, mitokondriyal disfonksiyonu değerlendirmek için birkaç yöntem vardır 10,11,12,1 3; bununla birlikte, geleneksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) üstün duyarlılık ve avantajlar sunar 13,14. Örneğin, HRR protokolleri, tüm mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun veya spesifik mitokondriyal komplekslerinaktivitesinin değerlendirilmesine izin verir 14,15. Mitokondriyal disfonksiyonlar sağlam hücrelerde, izole mitokondrilerde ve hatta ex vivo olarak değerlendirilebilir 10,11,13,14.
Mitokondriyal disfonksiyonlar birçok patolojik ve fizyolojik süreçle yakından ilişkilidir. Bu nedenle, genetik ve deneysel olarak izlenebilir model sistemleri kullanarak mitokondriyal fizyoloji ve biyoenerjetik çalışmak önemlidir. Bu bağlamda, meyve sineği olan Drosophila melanogaster üzerine yapılan araştırmaların çeşitli avantajları vardır. Bu model, DNA’nın genetik materyal olarak kullanımı, ortak organeller ve gelişim, bağışıklık ve hücre sinyalizasyonunda yer alan korunmuş moleküler yollar dahil olmak üzere insanlarla temel hücresel özellikleri ve süreçleri paylaşır. Ek olarak, meyve sinekleri hızlı bir yaşam döngüsüne, kolay bakıma, düşük maliyete, yüksek verime ve daha az etik kaygıya sahiptir, bu nedenle karmaşık hücresel süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araç oluşturur 16,17,18,19,20.
Ayrıca, PTEN’in neden olduğu varsayılan kinaz 1 (pembe1) geninin bir homologu D. melanogaster’de eksprese edilir. Mitofaji süreci boyunca hasarlı mitokondrinin uzaklaştırılmasında çok önemli bir rol oynar8. İnsanlarda, bu gendeki mutasyonlar, bireyleri mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili otozomal resesif ailesel bir PD formuna yatkın hale getirir 8,21,22,23. Sonuç olarak, meyve sineği, PH’nin patofizyolojisi ve mitokondriyal disfonksiyon ve biyoenerjetiklere odaklanan ilaç adaylarının taranması üzerine çalışmalar için güçlü bir hayvan modelidir. Bu nedenle, bu çalışma, Substrat-Birleştirici-İnhibitör-Titrasyon (SUIT) protokolü ile OROBOROS’ta HRR tekniği kullanılarak D. melanogaster’den bir PD modelinde mitokondriyal fonksiyonun nasıl analiz edileceğini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR, D. melanogaster ve diğer organizmalarda mitokondriyal solunum ve enerji metabolizmasını incelemek için güçlü bir tekniktir. Mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı ve nicel bir değerlendirmesini sağlayarak araştırmacıların hücrelerin biyoenerjetik hakkında fikir edinmelerini sağlar. Burada sunulan protokol, mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunun ve spesifik mitokondriyal komplekslerin aktivitesinin değerlendirilmesini açıklar. SUIT protokolü, mitokondriyal solunumun farklı …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Brezilya ajansı Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior’u (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020) kabul etmektedir. P.M. (#88887.512821/2020-00) ve T.D. (#88887.512883/2020-00) araştırma bursu alıcılarıdır.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Génétique. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
