Analyse af mitokondriefunktion i en Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutant ved hjælp af respirometri med høj opløsning
Summary
Her præsenterer vi en respirometriprotokol med høj opløsning til analyse af bioenergetik i PINK1B9-null mutante frugtfluer. Metoden anvender SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Abstract
Neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), og cellulære forstyrrelser som kræft er nogle af de lidelser, der forstyrrer energimetabolisme med forringelse af mitokondriefunktioner. Mitokondrier er organeller, der styrer både energimetabolisme og cellulære processer involveret i celleoverlevelse og død. Af denne grund kan tilgange til evaluering af mitokondriefunktion give vigtig indsigt i cellulære tilstande i patologiske og fysiologiske processer. I denne henseende tillader højopløsningsrespirometri (HRR) protokoller evaluering af hele mitokondriel respiratorisk kædefunktion eller aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser. Desuden kræver undersøgelse af mitokondriel fysiologi og bioenergetik genetisk og eksperimentelt håndterbare modeller som Drosophila melanogaster.
Denne model præsenterer flere fordele, såsom dens lighed med menneskelig fysiologi, dens hurtige livscyklus, nem vedligeholdelse, omkostningseffektivitet, høj gennemstrømningskapacitet og et minimeret antal etiske bekymringer. Disse attributter etablerer det kollektivt som et uvurderligt værktøj til dissekering af komplekse cellulære processer. Dette arbejde forklarer, hvordan man analyserer mitokondriefunktionen ved hjælp af Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutanten. Pink1-genet er ansvarlig for kodning af PTEN-induceret formodet kinase 1 gennem en proces, der anerkendes som mitofagi, hvilket er afgørende for fjernelse af dysfunktionelle mitokondrier fra mitokondrienetværket. Mutationer i dette gen har været forbundet med en autosomal recessiv tidlig debut familiær form for PD. Denne model kan bruges til at studere mitokondriel dysfunktion involveret i patofysiologien af PD.
Introduction
Mitokondrier er cellulære organeller, der styrer vigtige funktioner, herunder apoptotisk regulering, calciumhomeostase og deltagelse i biosyntetiske veje. Ved at besidde autonomt genetisk materiale er de i stand til at bidrage til cellulære vedligeholdelses- og reparationsprocesser. Deres struktur huser elektrontransportkæden og oxidativ fosforylering, begge afgørende for cellulær energi 1,2,3. Energikontrol opnås især gennem adenosintrifosfat (ATP) produktion via oxidativ phosphorylering (OXPHOS)2. Forstyrrelse af energimetabolisme med svækkelse af mitokondriefunktioner forekommer både i celleoverlevelse og død 4,5, ofte forbundet med en lang række humane patologier, såsom kræft og neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom (PD)3,6.
PD er en kronisk, progressiv og neurologisk lidelse. Den primære årsag til denne sygdom er hjernecellernes død, især i substantia nigra, som er ansvarlige for produktionen af neurotransmitterdopamin, som styrer bevægelse 6,7,8. Den tidligste observation, der forbandt Parkinsonisme med mitokondriel dysfunktion, blev foretaget i 1988 i eksperimentelle modeller ved hjælp af toksiner, der hæmmer respirationskæden Complex I9.
I øjeblikket er der flere metoder til evaluering af mitokondriel dysfunktion 10,11,12,1 3; sammenlignet med konventionelle tilgange giver respirometri med høj opløsning (HRR) imidlertid overlegen følsomhed og fordele13,14. For eksempel tillader HRR-protokoller evaluering af hele mitokondrie-respirationskædefunktionen eller aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser14,15. Mitokondrie dysfunktioner kan vurderes i intakte celler, isolerede mitokondrier eller endda ex vivo 10,11,13,14.
Mitokondrie dysfunktioner er tæt forbundet med mange patologiske og fysiologiske processer. Det er derfor vigtigt at studere mitokondriefysiologi og bioenergetik ved hjælp af genetisk og eksperimentelt håndterbare modelsystemer. I denne henseende har forskning på Drosophila melanogaster, frugtfluen, flere fordele. Denne model deler grundlæggende cellulære egenskaber og processer med mennesker, herunder brugen af DNA som genetisk materiale, fælles organeller og bevarede molekylære veje involveret i udvikling, immunitet og cellesignalering. Derudover har bananfluer en hurtig livscyklus, nem vedligeholdelse, lave omkostninger, høj gennemstrømning og færre etiske bekymringer, hvilket udgør et uvurderligt værktøj til at dissekere komplekse cellulære processer 16,17,18,19,20.
Desuden udtrykkes en homolog af det PTEN-inducerede formodede kinase 1 (pink1) gen i D. melanogaster. Det spiller en afgørende rolle i fjernelsen af beskadigede mitokondrier gennem processen med mitofagi:8. Hos mennesker prædisponerer mutationer i dette gen individer for en autosomal recessiv familiær form af PD forbundet med mitokondriel dysfunktion 8,21,22,23. Derfor er bananfluen en stærk dyremodel til studier af patofysiologien af PD og screening af lægemiddelkandidater med fokus på mitokondriel dysfunktion og bioenergetik. Derfor forklarer dette arbejde, hvordan man analyserer mitokondriefunktion i en model af PD fra D. melanogaster ved hjælp af HRR-teknikken i OROBOROS med SUIT-protokollen (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
Protocol
Representative Results
Discussion
HRR er en kraftfuld teknik til at studere mitokondriel respiration og energimetabolisme i D. melanogaster og andre organismer. Det giver en detaljeret og kvantitativ vurdering af mitokondriefunktionen, så forskerne kan få indsigt i cellernes bioenergetik. Protokollen, der præsenteres her, beskriver evalueringen af mitokondriel respiratorisk kædefunktion og aktiviteten af specifikke mitokondriekomplekser ved anvendelse af SUIT-protokollen i D. melanogaster. SUIT-protokollen involverer systematisk man…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender det brasilianske agentur Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) og T.D. (#88887.512883/2020-00) er modtagere af forskningsstipendier.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol. |
| Ágar | Kasv | K25-1800 | For bacteriologal use |
| Antimycin-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight 540 g/mol; |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | CAS number 11024-24-1 |
| Distilled water | |||
| Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Obtained from Bloomington Drosophila stock center | ||
| Drosophila melanogaster strain w1118 | Obtained from the Federal University of Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder |
| GraphPad Prism version 8.0.1. | Software for data acquisition and analysis | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets |
| Malate | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0. |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number 1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC) |
| Pistil to homogenization | |||
| Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S 2378 | Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99% |
| Sucrose | Merck | 107,651,000 | Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | CAS number 107-35-7 |
References
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
- Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
- Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
- Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
- Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
- DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
- Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
- Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
- Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
- Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
- Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Génétique. 201 (3), 815-842 (2015).
- McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
- Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
- Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
- Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
- Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
- Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
- Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
- Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
- Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
- Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
- Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
- Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
- Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
- Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
- Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
- Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
