Summary

Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

En este trabajo presentamos un protocolo de respirometría de alta resolución para analizar la bioenergética en moscas de la fruta mutantes PINK1B9-nulas. El método utiliza el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Abstract

Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), y las alteraciones celulares como el cáncer son algunos de los trastornos que alteran el metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos que controlan tanto el metabolismo energético como los procesos celulares implicados en la supervivencia y muerte celular. Por esta razón, los enfoques para evaluar la función mitocondrial pueden ofrecer información importante sobre las condiciones celulares en los procesos patológicos y fisiológicos. En este sentido, los protocolos de respirometría de alta resolución (HRR) permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos. Además, el estudio de la fisiología mitocondrial y la bioenergética requiere modelos genética y experimentalmente manejables como Drosophila melanogaster.

Este modelo presenta varias ventajas, como su similitud con la fisiología humana, su rápido ciclo de vida, su fácil mantenimiento, su rentabilidad, su alto rendimiento y su minimización del número de preocupaciones éticas. Estos atributos lo establecen colectivamente como una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos. El presente trabajo explica cómo analizar la función mitocondrial utilizando el mutante PINK1B9-null de Drosophila melanogaster. El gen pink1 es responsable de codificar la quinasa putativa 1 inducida por PTEN, a través de un proceso reconocido como mitofagia, que es crucial para la eliminación de mitocondrias disfuncionales de la red mitocondrial. Las mutaciones en este gen se han asociado con una forma familiar autosómica recesiva de inicio temprano de la EP. Este modelo se puede utilizar para estudiar la disfunción mitocondrial implicada en la fisiopatología de la EP.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos celulares que controlan funciones importantes, incluida la regulación apoptótica, la homeostasis del calcio y la participación en las vías biosintéticas. Al poseer material genético autónomo, son capaces de contribuir a los procesos de mantenimiento y reparación celular. Su estructura alberga la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, ambas cruciales para la energía celular 1,2,3. En particular, el control de la energía se logra a través de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS)2. La alteración del metabolismo energético con deterioro de las funciones mitocondriales ocurre tanto en la supervivencia como en la muerte celular 4,5, frecuentemente asociada a una amplia gama de patologías humanas, como el cáncer, y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson (EP)3,6.

La EP es un trastorno crónico, progresivo y neurológico. La causa principal de esta enfermedad es la muerte de las células cerebrales, especialmente en la sustancia negra, que son responsables de la producción del neurotransmisor dopamina, que controla el movimiento 6,7,8. La primera observación que relacionó el parkinsonismo con la disfunción mitocondrial se realizó en 1988, en modelos experimentales utilizando toxinas que inhiben la cadena respiratoria Complejo I9.

Actualmente, existen varios métodos para evaluar la disfunción mitocondrial 10,11,12,1 3; sin embargo, en comparación con los abordajes convencionales, la respirometría de alta resolución (HRR) presenta una sensibilidad y ventajas superiores13,14. Por ejemplo, los protocolos de HRR permiten evaluar toda la función de la cadena respiratoria mitocondrial o la actividad de complejos mitocondriales específicos14,15. Las disfunciones mitocondriales pueden evaluarse en células intactas, mitocondrias aisladas o incluso ex vivo 10,11,13,14.

Las disfunciones mitocondriales están estrechamente asociadas con muchos procesos patológicos y fisiológicos. Por lo tanto, es importante estudiar la fisiología mitocondrial y la bioenergética utilizando sistemas modelo genética y experimentalmente tratables. En este sentido, la investigación sobre Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, tiene varias ventajas. Este modelo comparte características y procesos celulares fundamentales con los seres humanos, incluido el uso del ADN como material genético, orgánulos comunes y vías moleculares conservadas involucradas en el desarrollo, la inmunidad y la señalización celular. Además, las moscas de la fruta tienen un ciclo de vida rápido, fácil mantenimiento, bajo costo, alto rendimiento y menos preocupaciones éticas, lo que constituye una herramienta invaluable para diseccionar procesos celulares complejos 16,17,18,19,20.

Además, un homólogo del gen de la quinasa putativa 1 (pink1) inducido por PTEN se expresa en D. melanogaster. Desempeña un papel crucial en la eliminación de mitocondrias dañadas a través del proceso de mitofagia8. En humanos, las mutaciones en este gen predisponen a los individuos a una forma familiar autosómica recesiva de EP asociada a disfunción mitocondrial 8,21,22,23. En consecuencia, la mosca de la fruta es un poderoso modelo animal para estudios sobre la fisiopatología de la EP y el cribado de candidatos a fármacos centrados en la disfunción mitocondrial y la bioenergética. Por lo tanto, en el presente trabajo se explica cómo analizar la función mitocondrial en un modelo de EP de D. melanogaster utilizando la técnica HRR en el OROBOROS con el protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Protocol

Utilizamos las cepas w1118 (blanca) y w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (denominada Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) del centro de stock Bloomington Drosophila (número de identificación: 34749). En este estudio, se comparan mutantes machos de D. melanogaster PINK1B9-null con machos de D. melanogaster de la cepa w1118, que se utiliza como grupo de control (antecedentes genéticos). Otros parámetros deben ser analizados co…

Representative Results

Aquí, observamos que el flujo de O2 en los estados OXPHOS CI (P = 0.0341) y OXPHOS CI&II (P = 0.0392) se reduce en las moscas nulas PINK1B9 en comparación con las moscas de control (Figura 4). Este resultado también se observó en hallazgos previos de nuestro grupo29,30. El CI y el CII son componentes clave del sistema de transporte de electrones (ETS), e…

Discussion

La HRR es una técnica poderosa para estudiar la respiración mitocondrial y el metabolismo energético en D. melanogaster y otros organismos. Proporciona una evaluación detallada y cuantitativa de la función mitocondrial, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la bioenergética de las células. El protocolo presentado aquí describe la evaluación de la función de la cadena respiratoria mitocondrial y la actividad de complejos mitocondriales específicos utilizando el protocolo SUIT e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a la agencia brasileña Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) y T.D. (#88887.512883/2020-00) son beneficiarios de becas de investigación.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A5285 Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 72696-48-1); ≥95%; molecular weight = 501.31 g/mol.
Ágar Kasv K25-1800 For bacteriologal use
Antimycin-A Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight  540 g/mol;
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Bovine Serum Albumin (CAS number 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
Digitonin Sigma-Aldrich D 5628 CAS number 11024-24-1
Distilled water
Drosophila melanogaster strain w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 Obtained from Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster strain w1118 Obtained  from the Federal University of Santa Maria
EGTA Sigma-Aldrich E8145 Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 13638-13-3); ≥97%; molecular weight =468.28 g/mol
FCCP Sigma-Aldrich C2920 Carbonyl cyanide 4- (trifluoromethoxy)phenylhydrazone  (CAS number 370-86-5); ≥98% (TLC), powder 
GraphPad Prism version 8.0.1. Software for data acquisition and analysis
Hepes Sigma-Aldrich H4034 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9); ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight = 238.30 g/mol
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379 Monopotassium phosphate (CAS number 7778-77-0); Reagente Plus, molecular weigt = 136.09 g/mol
KOH Sigma-Aldrich 211473 Potassium hydroxide (CAS number 1310-58-3); ACS reagent, ≥85%, pellets
Malate Sigma-Aldrich M1296 Malonic acid (CAS number 141-82-2); 99%, molecular weight = 104.06 g/mol). A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
Malic acid Sigma-Aldrich M1000 (S)-(−)-2-Hydroxysuccinic acid (CAS number 97-67-6); ≥95% ; molecular weight = 134.09 g/mol
MES Sigma-Aldrich M3671 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (CAS number 4432-31-9); ≥99% (titration); molecular weight = 195.24 g/mol
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Magnesium chloride (CAS number 7786-30-3); anhydrous, ≥98%, molecular weight = 95.21 g/mol
Microcentrifuge tubes Eppendorf
O2K-Titration Set Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
Oligomycin Sigma-Aldrich O 4876 Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes (CAS number  1404-19-9); ≥90% total oligomycins basis (HPLC)
Pistil to homogenization
Proline Sigma-Aldrich P0380 L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/ mol
Succinate Sigma-Aldrich S 2378 Sodium succinate dibasic hexahydrate (CAS number 6106-21-4); ≥99%
Sucrose Merck 107,651,000 Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1)
Taurine Sigma-Aldrich T0625 CAS number 107-35-7

References

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216 (2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908 (2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838 (2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders – A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson’s disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332 (2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson’s disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson’s disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -. F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine – use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Génétique. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson’s disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson’s disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson’s disease. Gene. 857, 147183 (2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. . Choosing and using statistics: a biologist’s guide. , (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794 (2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson’s disease. PloS One. 9 (10), e110802 (2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916 (2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).
check_url/fr/65664?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Michelotti, P., Duarte, T., Dalla Corte, C. L. Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (201), e65664, doi:10.3791/65664 (2023).

View Video