偏振敏感双光子显微镜用于无标记淀粉样蛋白结构表征

Summary

本文描述了如何应用偏振敏感双光子显微镜来表征无标记淀粉样蛋白超结构-球晶中的局部组织。它还描述了如何制备和测量样品、组装所需的设置以及分析数据以获取有关淀粉样蛋白原纤维局部组织的信息。

Abstract

与单光子激发相比，双光子激发有利于生物成像实验，因为它具有较低的光毒性、更深的组织穿透性、在密集系统中的高效操作以及减少荧光团的角度光选择。因此，与基于线性光学过程的标准成像方法相比，在双光子荧光显微镜 （2PFM） 中引入偏振分析可以更精确地确定样品中的分子组织。在这项工作中，我们重点研究了偏振敏感的2PFM（ps-2PFM）及其在复杂生物结构-淀粉样蛋白球晶中分子有序测定中的应用。阿尔茨海默氏症或帕金森氏症等神经退行性疾病通常通过检测由于蛋白质错误折叠过程受损而形成的淀粉样蛋白-蛋白质聚集体来诊断。探索它们的结构可以更好地了解它们的产生途径，从而开发更灵敏的诊断方法。本文介绍了适用于测定牛胰岛素球晶和球形淀粉样蛋白聚集体内部局部原纤维顺序的ps-2PFM。此外，我们证明了所提出的技术可以解决球状体内部原纤维的三维组织。

Introduction

在过去的几十年中，尽管许多用于蛋白质及其聚集体生物成像的荧光显微镜技术已经取得了重大发展¹，但只有少数技术被用于解析它们在样品中的局部排序 ^2,3。采用荧光寿命成像显微镜⁴研究了淀粉样蛋白超结构-球晶的内在结构异质性。此外，可以使用偏振^{敏感方法解决}复杂和致密的生物结构（如球晶）内部局部顺序的定量测定3。然而，具有浅层组织穿透的标准荧光技术是有限的，因为使用紫外可见分光度在体内激发荧光团会导致高组织光散射⁵。此外，这种成像通常需要设计特定的荧光探针并将其结合到目标生物分子上，从而增加了执行成像所需的成本和工作量。

最近，为了解决这些问题，我们的团队采用了偏振敏感双光子激发荧光显微镜 （ps-2PFM） 对生物结构进行无标记成像 ^6,7。Ps-2PFM允许测量双光子荧光强度对激发光束线性偏振方向的依赖性，并分析发射荧光^的偏振8。该技术的实施需要用半波板补充标准多光子显微镜设置激发路径（图1）以控制光偏振平面。然后，从两个雪崩光电二极管收集的信号中创建极坐标图，描述双光子激发荧光强度对激发激光束偏振的依赖性，从而收集荧光偏振的两个相互垂直的分量。

最后一步是数据分析过程，考虑到光学元件（如二向色镜或高数值孔径物镜）对偏振的影响。由于双光子过程的性质，这种方法既减少了角度选择，又提高了轴向分辨率，因为焦平面外荧光团的双光子激发在概率上受到限制。还证明，类似的方法可以成功地用于近红外探针 （NIR） 的体内成像，用于深部组织成像⁹。Ps-2PFM先前已应用于细胞膜¹⁰和DNA^11,12中的成像荧光团，以及生物系统的非标准荧光标记物，例如金纳米颗粒¹³。然而，在所有这些例子中，有关生物分子组织的信息都是间接获得的，并且需要荧光团和生物分子之间预定义的相互取向。

在我们最近的一篇论文中，我们已经证明 ps-2PFM 可以成功地用于确定淀粉样蛋白超结构的自发荧光的局部极化和硫黄素 T（一种淀粉样蛋白特异性染料）与球晶中的淀粉样蛋白原纤维结合的荧光⁶。此外，在另一项研究中，我们已经证明 ps-2PFM 可用于检测亚微米尺寸范围内淀粉样蛋白球晶内的淀粉样蛋白原纤维取向，这通过将其与透射电子显微镜 （TEM） 成像相关联来证实⁷.这一结果的实现得益于：i）球晶-淀粉样蛋白的内在自发荧光，当用一个或两个光子激发时，表现出内在的自发荧光，最大发射波长位于450至500nm范围内，双光子吸收截面与标准荧光染料相当^14，ii）前面介绍的数学模型，用于描述如何将标记生物膜和DNA结构的染料的ps-2PEF应用于球晶和与其结合的染料表现出的荧光 ^8,11,15。因此，在进行分析之前，我们强烈建议您仔细阅读我们关于该主题的第一篇论文的正文和支持信息中描述的所需理论⁶.在这里，我们介绍了如何应用ps-2PFM技术对牛胰岛素球晶进行无标记淀粉样蛋白结构表征的方案。

Protocol

1.用完全生长的球晶准备显微镜载玻片 注意：有关本协议中使用的所有材料，试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。所有溶液均采用从净水系统获得的去离子水（25 °C时为18.2 MΩ·cm）制备。 根据Krebs等人描述的方案孵育淀粉样球晶16。 进行一些修改，如下所述。在 1.5 mL 试管中称取 10 mg 胰岛素粉。 用…

Representative Results

所提出的方案通过制备用于 ps-2PFM 测试的淀粉样蛋白超结构、微观系统的构建和适当样品的测量提供了分步指导。然而，在进行最终一组测量之前，将APD与各向同性参考正确对齐至关重要，这应该会导致在两个探测器上收集形状和强度相似的对称信号（图4C）。在进一步的测量中，特别是在分析过程中，应将检测器在X轴和Y轴上测量的强度之间的最小差异作为适当的校正因子…

Discussion

偏振敏感双光子显微镜是研究淀粉样蛋白超结构内部原纤维局部有序的宝贵工具，只需对标准多光子设置进行微小修改。由于它对非线性光学现象起作用，因此与单光子激发荧光显微镜方法相比，可以减少角度光选择并增强轴向分辨率。此外，与单光子激发荧光显微镜技术相比，它可降低光散射、降低光毒性和更深的样品穿透力^19,20。正如我们已经证明…

Materials

Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5