Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden
Summary
Dit artikel beschrijft hoe polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie kan worden toegepast om de lokale organisatie binnen labelvrije amyloïde superstructuren-sferulieten te karakteriseren. Het beschrijft ook hoe het monster moet worden voorbereid en gemeten, de vereiste opstelling moet worden samengesteld en de gegevens moeten worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de lokale organisatie van amyloïde fibrillen.
Abstract
Vergeleken met zijn tegenhanger met één foton is excitatie met twee fotonen gunstig voor bioimaging-experimenten vanwege de lagere fototoxiciteit, diepere weefselpenetratie, efficiënte werking in dicht opeengepakte systemen en verminderde hoekfotoselectie van fluoroforen. De introductie van polarisatieanalyse in twee-fotonfluorescentiemicroscopie (2PFM) zorgt dus voor een nauwkeurigere bepaling van de moleculaire organisatie in een monster in vergelijking met standaard beeldvormingsmethoden op basis van lineaire optische processen. In dit werk richten we ons op polarisatiegevoelige 2PFM (ps-2PFM) en de toepassing ervan bij de bepaling van moleculaire ordening binnen complexe biostructuren-amyloïde sferulieten . Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson worden vaak gediagnosticeerd door de detectie van amyloïde-eiwitaggregaten die worden gevormd als gevolg van een verstoord eiwitmisvouwingsproces. Het onderzoeken van hun structuur leidt tot een beter begrip van hun creatiepad en bijgevolg tot het ontwikkelen van gevoeligere diagnostische methoden. Dit artikel presenteert de ps-2PFM die is aangepast voor de bepaling van lokale fibrilordening in de runderinsuline-sferulieten en sferische amyloïdogene eiwitaggregaten. Bovendien bewijzen we dat de voorgestelde techniek de driedimensionale organisatie van fibrillen in de sferuliet kan oplossen.
Introduction
In de afgelopen decennia, hoewel er een aanzienlijke ontwikkeling is geweest van talrijke fluorescentiemicroscopietechnieken voor bioimaging van eiwitten en hun aggregaten1, zijn er slechts enkele gebruikt om hun lokale ordening binnen het monster op te lossen 2,3. Fluorescentie lifetime imaging microscopie4 werd gebruikt om de intrinsieke structurele heterogeniteit van amyloïde superstructuren-sferulieten te bestuderen. Bovendien zou kwantitatieve bepaling van de lokale ordening in complexe en dicht opeengepakte biostructuren zoals sferulieten kunnen worden opgelost met behulp van polarisatiegevoelige methoden3. Standaard fluorescentietechnieken met oppervlakkige weefselpenetratie zijn echter beperkt, aangezien het gebruik van UV-VIS-golflengten om fluoroforen in vivo te exciteren leidt tot een hoge verstrooiing van weefsellicht5. Bovendien vereist dergelijke beeldvorming vaak het ontwerpen en binden van specifieke fluorescerende sondes aan een gericht biomolecuul, waardoor de kosten en de hoeveelheid werk die nodig is om beeldvorming uit te voeren, toenemen.
Om deze problemen aan te pakken, heeft ons team onlangs de polarisatiegevoelige twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (ps-2PFM) aangepast voor labelvrije beeldvorming van biologische structuren 6,7. Ps-2PFM maakt het mogelijk om de afhankelijkheid van de intensiteit van de fluorescentie van twee fotonen te meten van de richting van de lineaire polarisatie van de excitatiestraal en de polarisatie van de uitgezonden fluorescentiete analyseren 8. De implementatie van deze techniek vereist aanvulling van het standaard excitatiepad van de multi-fotonenmicroscoopopstelling (Figuur 1) met een halfgolfplaat om het lichtpolarisatievlak te regelen. Vervolgens worden polaire grafieken, die de afhankelijkheid van de intensiteit van de geëxciteerde fluorescentie met twee fotonen van de polarisatie van de excitatielaserstraal weergeven, gemaakt van signalen die worden verzameld door twee lawinefotodiodes, waardoor de twee, onderling loodrecht op elkaar staande componenten van fluorescentiepolarisatie worden verzameld.
De laatste stap is het data-analyseproces, waarbij rekening wordt gehouden met de impact van de optische elementen, zoals dichroïsche spiegels of een objectief met een hoge numerieke apertuur, op polarisatie. Vanwege de aard van het twee-fotonproces biedt deze methode zowel een verminderde hoekfotoselectie als een verbeterde axiale resolutie, aangezien de excitatie van fluoroforen met twee fotonen buiten het brandpuntsvlak waarschijnlijk beperkt is. Het werd ook bewezen dat soortgelijke methoden met succes konden worden geïmplementeerd voor in vivo beeldvorming van nabij-infraroodsondes (NIR)voor beeldvorming van diep weefsel9. Ps-2PFM is eerder toegepast op beeldfluoroforen in celmembranen10 en DNA11,12, evenals niet-standaard fluorescerende markers van biologische systemen, zoals gouden nanodeeltjes13. In al deze voorbeelden werd de informatie over de organisatie van biomoleculen echter indirect verkregen en vereiste een vooraf gedefinieerde wederzijdse oriëntatie tussen een fluorofoor en een biomolecuul.
In een van onze recente artikelen hebben we aangetoond dat ps-2PFM met succes kan worden toegepast voor het bepalen van de lokale polarisatie van de autofluorescentie van amyloïde superstructuren en fluorescentie van thioflavine T, een amyloïde-specifieke kleurstof, gebonden aan amyloïde fibrillen in sferulieten6. Bovendien hebben we in een andere bewezen dat ps-2PFM kan worden gebruikt om de oriëntatie van amyloïde fibrillen in amyloïde sferulieten te detecteren in een regime van submicrongrootte, wat werd bevestigd door het te correleren met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming7. Het bereiken van dit resultaat was mogelijk dankzij i) intrinsieke autofluorescentie van sferulieten en amyloïden, wanneer ze worden geëxciteerd met één of twee fotonen, intrinsieke autofluorescentie vertonen met emissiemaxima in een bereik van 450 tot 500 nm en absorptiedoorsneden van twee fotonen die vergelijkbaar zijn met standaard fluorescerende kleurstoffen14, ii) wiskundige modellen die eerder zijn geïntroduceerd om te beschrijven hoe ps-2PEF van kleurstoffen die biologische membranen en DNA-structuren labelen, kunnen worden toegepast op fluorescentie vertoond door sferulieten en kleurstoffen die eraan zijn gebonden 8,11,15. Daarom raden we ten zeerste aan om, voordat we verder gaan met de analyse, de vereiste theorie door te nemen die wordt beschreven in zowel de hoofdtekst als de ondersteunende informatie van ons eerste artikel over dit onderwerp6. Hier presenteren we het protocol voor het toepassen van de ps-2PFM-techniek voor een labelvrije amyloïde structurele karakterisering van runderinsuline sferulieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de lokale ordening van fibrillen in de amyloïde superstructuren, waarvoor slechts kleine aanpassingen van de standaard multifotonenopstelling nodig zijn. Omdat het werkt op niet-lineaire optische verschijnselen, kunnen verminderde hoekfotoselectie en verbeterde axiale resolutie worden bereikt in vergelijking met één-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopiemethoden. Bovendien leidt het tot een lagere lichtverstrooiing, la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Sonata Bis 9-project (2019/34/E/ST5/00276), gefinancierd door het Nationaal Wetenschapscentrum in Polen.
Materials
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures – local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc’h, V., Brasselet, S., Roch, J. -. F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer’s disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., Mély, Y., Duportail, G., et al. . Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. , 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
