एक लेबल-मुक्त अमाइलॉइड संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी
Summary
यह पत्र बताता है कि ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को लेबल-मुक्त अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर-स्फेरुलाइट्स के भीतर स्थानीय संगठन को चिह्नित करने के लिए कैसे लागू किया जा सकता है। यह यह भी वर्णन करता है कि नमूना कैसे तैयार करें और मापें, आवश्यक सेटअप को इकट्ठा करें, और अमाइलॉइड फाइब्रिल के स्थानीय संगठन के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए डेटा का विश्लेषण करें।
Abstract
अपने एक-फोटॉन समकक्ष की तुलना में, दो-फोटॉन उत्तेजना बायोइमेजिंग प्रयोगों के लिए फायदेमंद है क्योंकि इसकी कम फोटोटॉक्सिसिटी, गहरी ऊतक पैठ, घनी पैक प्रणालियों में कुशल संचालन, और फ्लोरोफोर्स के कोणीय फोटोसेलेक्शन को कम किया जाता है। इस प्रकार, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2PFM) में ध्रुवीकरण विश्लेषण की शुरूआत रैखिक ऑप्टिकल प्रक्रियाओं के आधार पर मानक इमेजिंग विधियों की तुलना में एक नमूने में आणविक संगठन का अधिक सटीक निर्धारण प्रदान करती है। इस काम में, हम ध्रुवीकरण-संवेदनशील 2PFM (ps-2PFM) और जटिल जैव-संरचनाओं-एमिलॉइड स्फेरुलाइट्स के भीतर आणविक क्रम के निर्धारण में इसके अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। अल्जाइमर या पार्किंसंस जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का निदान अक्सर एक बिगड़ा हुआ प्रोटीन मिसफोल्डिंग प्रक्रिया के कारण गठित एमाइलॉयड्स-प्रोटीन समुच्चय का पता लगाने के माध्यम से किया जाता है। उनकी संरचना की खोज से उनके निर्माण मार्ग की बेहतर समझ होती है और परिणामस्वरूप, अधिक संवेदनशील नैदानिक विधियों को विकसित किया जाता है। यह पेपर गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स और गोलाकार अमाइलॉइडोजेनिक प्रोटीन समुच्चय के अंदर स्थानीय फाइब्रिल ऑर्डरिंग के निर्धारण के लिए अनुकूलित ps-2PFM प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, हम साबित करते हैं कि प्रस्तावित तकनीक गोलाकार के अंदर फाइब्रिल के त्रि-आयामी संगठन को हल कर सकती है।
Introduction
पिछले दशकों में, हालांकि प्रोटीन और उनके समुच्चय1 की बायोइमेजिंग के लिए कई प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीकों का महत्वपूर्ण विकास हुआ है, केवल कुछ का उपयोग नमूना 2,3 के भीतर अपने स्थानीय आदेश को हल करने के लिए किया गया है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी4 का उपयोग अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर-स्फेरुलाइट्स की आंतरिक संरचनात्मक विषमता का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, इस तरह के spherulites के रूप में जटिल और घनी पैक biostructures के अंदर स्थानीय आदेश के मात्रात्मक निर्धारण ध्रुवीकरण संवेदनशील तरीकों3 का उपयोग कर हल किया जा सकता है. हालांकि, सतही ऊतक पैठ के साथ मानक प्रतिदीप्ति तकनीक सीमित हैं क्योंकि विवो में फ्लोरोफोर्स को उत्तेजित करने के लिए यूवी-वीआईएस तरंग दैर्ध्य का उपयोग करने से उच्च ऊतक प्रकाश बिखरने की ओर जाता है5. इसके अलावा, इस तरह की इमेजिंग को अक्सर लक्षित बायोमोलेक्यूल के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच को डिजाइन करने और बाध्य करने की आवश्यकता होती है, जिससे इमेजिंग करने के लिए आवश्यक लागत और कार्य की मात्रा बढ़ जाती है।
हाल ही में, इन मुद्दों को हल करने के लिए, हमारी टीम ने जैविक संरचनाओं 6,7 के लेबल-मुक्त इमेजिंग के लिए ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन उत्साहित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ps-2PFM) को अनुकूलित किया है। Ps-2PFM उत्तेजना बीम के रैखिक ध्रुवीकरण की दिशा में दो फोटॉन प्रतिदीप्ति तीव्रता की निर्भरता और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति8 के ध्रुवीकरण के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक के कार्यान्वयन के लिए प्रकाश ध्रुवीकरण विमान को नियंत्रित करने के लिए एक आधा लहर प्लेट के साथ मानक बहु फोटॉन माइक्रोस्कोप सेटअप उत्तेजना पथ (चित्रा 1) के पूरक की आवश्यकता है. फिर, ध्रुवीय ग्राफ, उत्तेजना लेजर बीम के ध्रुवीकरण पर दो-फोटॉन उत्तेजित प्रतिदीप्ति तीव्रता की निर्भरता का चित्रण, दो हिमस्खलन फोटोडायोड द्वारा एकत्र किए गए संकेतों से बनाए जाते हैं, इस प्रकार प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण के दो, पारस्परिक रूप से लंबवत घटकों को इकट्ठा करते हैं।
अंतिम चरण डेटा विश्लेषण प्रक्रिया है, जो ध्रुवीकरण पर ऑप्टिकल तत्वों, जैसे डाइक्रोइक दर्पण या उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य के प्रभाव को ध्यान में रखता है। दो-फोटॉन प्रक्रिया की प्रकृति के कारण, यह विधि कम कोणीय फोटो-चयन और बढ़ाया अक्षीय संकल्प दोनों प्रदान करती है, क्योंकि फोकल विमान के बाहर फ्लोरोफोर्स के दो-फोटॉन उत्तेजना संभाव्य रूप से सीमित है। यह भी साबित हुआ कि इसी तरह के तरीकों को सफलतापूर्वक गहरे ऊतक इमेजिंग9 के लिए निकट-अवरक्त जांच (एनआईआर) के विवो इमेजिंग में लागू किया जा सकता है। Ps-2PFM पहले सेल झिल्ली10 और डीएनए 11,12, साथ ही सोने नैनोकणों13 के रूप में जैविक प्रणालियों के गैर मानक फ्लोरोसेंट मार्करों, में छवि fluorophores के लिए लागू किया गया है. हालांकि, इन सभी उदाहरणों में, बायोमोलेक्यूल्स के संगठन के बारे में जानकारी अप्रत्यक्ष रूप से प्राप्त की गई थी और एक फ्लोरोफोरे और एक बायोमोलेक्यूल के बीच एक पूर्वनिर्धारित पारस्परिक अभिविन्यास की आवश्यकता थी।
हमारे हाल के कागजात में से एक में, हमने दिखाया है कि ps-2PFM को थियोफ्लेविन टी से अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर और प्रतिदीप्ति के ऑटोफ्लोरेसेंस के स्थानीय ध्रुवीकरण का निर्धारण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, एक अमाइलॉइड-विशिष्ट डाई, जो स्फेरुलाइट्स6 में एमिलॉयड फाइब्रिल से बंधी है। इसके अलावा, एक और में, हमने साबित कर दिया है कि ps-2PFM का उपयोग उप-माइक्रोन आकार के शासन में अमाइलॉइड स्फेरुलाइट्स के अंदर अमाइलॉइड फाइब्रिल अभिविन्यास का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जिसकी पुष्टि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) इमेजिंग7 के साथ सहसंबंधित करके की गई थी। इस परिणाम की उपलब्धि i) स्फेरुलाइट्स-एमिलॉयड के आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए संभव थी, जब एक या दो फोटॉनों के साथ उत्साहित होते हैं, तो 450 से 500 एनएम की सीमा में स्थित उत्सर्जन मैक्सिमा के साथ आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं और मानक फ्लोरोसेंट रंगों के साथ तुलनीय दो-फोटॉन अवशोषण क्रॉस सेक्शन14, ii) गणितीय मॉडल पहले पेश किए गए थे कि जैविक झिल्ली और डीएनए संरचनाओं को लेबल करने वाले रंगों के ps-2PEF को कैसे लागू किया जा सकता है प्रतिदीप्ति गोलाकार और उन्हें करने के लिए बाध्य रंगों द्वारा प्रदर्शित 8,11,15. इस प्रकार, विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले, हम अत्यधिक अनुशंसा करते हैं कि दोनों में वर्णित आवश्यक सिद्धांत को देखें, मुख्य पाठ और इस विषय से संबंधित हमारे पहले पेपर की सहायक जानकारी6. यहां, हम गोजातीय इंसुलिन स्फेरुलाइट्स के लेबल-मुक्त अमाइलॉइड संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए ps-2PFM तकनीक को लागू करने के तरीके के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ध्रुवीकरण-संवेदनशील दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी अमाइलॉइड सुपरस्ट्रक्चर के अंदर फाइब्रिल के स्थानीय क्रम का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, जिसमें मानक मल्टीफोटन सेटअप के केवल छोटे संशोधनों की ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पोलैंड में राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र द्वारा वित्तपोषित सोनाटा बीआईएस 9 परियोजना (2019/34/ई/एसटी5/00276) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
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