インドシアニングリーン血管造影による新生血管加齢黄斑変性症の血管形態の特性評価
Summary
現在、フルオレセイン血管造影(FA)は、脈絡膜新生血管(CNV)の動物モデルにおける漏出パターンを特定するための好ましい方法です。ただし、FAは血管の形態に関する情報を提供しません。このプロトコルはマウス モデルでレーザー誘導されたCNVの異なった損害のタイプを特徴付けるのにインドシアニンの緑色の血管造影(ICGA)の使用を概説する。
Abstract
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者の失明の主な原因であり、人口の高齢化により有病率が急速に増加しています。脈絡膜新生血管(CNV)または滲出型AMDは、すべてのAMD症例の10%〜20%を占め、AMD関連の失明の驚くべき80%〜90%の原因となっています。現在の抗VEGF療法は、患者の約50%で最適でない反応を示しています。CNV患者における抗VEGF治療に対する耐性は、しばしば細動脈CNVと関連しているが、レスポンダーは毛細血管CNVを有する傾向がある。フルオレセイン血管造影(FA)は、滲出型AMD患者および動物モデルの漏出パターンを評価するために一般的に使用されますが、CNV血管形態(細動脈CNV と毛細血管CNV)に関する情報は提供しません。このプロトコルはレーザー誘導されたCNVマウス モデルの病変のタイプを特徴付けるのにindocyanineの緑色の血管造影(ICGA)の使用をもたらす。この方法は、滲出型AMDにおける抗VEGF耐性のメカニズムと治療戦略を調査するために重要です。機構的および治療的研究におけるCNVの漏出と血管の特徴の両方を包括的に評価するために、FAと一緒にICGAを組み込むことが推奨されます。
Introduction
加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者の重度の視力低下につながる一般的な状態です1。米国だけでも、AMD患者数は現在の1,100万人から2050年には2,200万人近くに達すると予測されています。世界全体では、AMDの推定症例数は2040年までに2億8,800万人に達すると予想されています2。
脈絡膜新生血管(CNV)は、「滲出型」または血管新生AMDとも呼ばれ、網膜中心の下に異常な血管が形成されるため、視力に壊滅的な影響を与える可能性があります。これは、出血、網膜の滲出、および重大な視力喪失につながります。細胞外VEGFを標的とする抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の導入は、CNV治療に革命をもたらしました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、患者の最大50%がこれらの治療法に対して最適ではない反応を示し、体液の蓄積や未解決の出血または新しい出血などの進行中の疾患活動性を示します3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。
臨床試験では、CNV患者の抗VEGF耐性は、大口径の分岐細動脈、血管ループ、および吻合部接続を特徴とする細動脈CNVの存在に対応することが多いことが示されています9。抗VEGF治療を繰り返すと、血管の異常、動脈CNVの発症、そして最終的には抗VEGF療法に対する耐性に寄与する可能性があります14,15。細動脈CNVの場合、持続的な体液漏れは、特に血流の多い条件下で、動静脈吻合ループのタイトジャンクションが不適切に形成されることによって引き起こされる滲出の増加が原因である可能性があります9。逆に、抗VEGF治療によく反応する個人は、毛細血管CNVを示す傾向があります。
動物モデルを用いた研究では、高齢マウスのレーザー誘導CNVが細動脈CNVを発症し、抗VEGF治療に対する耐性を示すことを実証しました16,17。逆に、若いマウスにおけるレーザー誘導CNVは、毛細血管CNVの発達と抗VEGF治療に対する高い反応性につながります。したがって、機構的研究と治療的研究の両方において、CNV血管タイプを区別することが重要です。
臨床現場では、CNVは一般的にフルオレセイン血管造影(FA)の漏出パターン(例、タイプ1、タイプ2)に基づいて分類され、フルオレセイン色素を使用して滲出を追跡し、病的漏出の領域を特定します。AMDの研究では、CNVは主に動物モデルでFAを使用して研究されています。しかし、FAはCNVの血管形態を明らかにすることができません。さらに、FAは可視光スペクトルの画像のみをキャプチャし、網膜色素上皮(RPE)の下の脈絡膜血管系を視覚化することはできません。対照的に、血漿タンパク質に強い親和性を示すインドシアニングリーン(ICG)は、優勢な血管内保持を促進し、血管構造と血流の可視化を可能にします9。ICGの近赤外蛍光特性を利用することで、ICG血管造影法(ICGA)を用いて網膜および脈絡膜色素を画像化することが可能になります。これに関連して、FAとICGAを組み合わせて、毛細血管と細動脈CNVが観察される若齢および老齢マウスにおけるレーザー誘発脈絡膜新生血管(CNV)の漏出と血管形態を調査するプロトコルが提示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、インドシアニングリーン血管造影(ICGA)を使用して、レーザー誘導CNVを使用したマウスモデルにおける細動脈および毛細血管脈絡膜新生血管(CNV)の血管形態を特定することが実証されました。インドシアニングリーン(ICG)色素のヘモグロビン結合および赤外光特性により、研究コミュニティで現在採用されているフルオレセイン血管造影(FA)では困難なCNV形態の検出が可能になり?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、BrightFocus Foundation、Retina Research Foundation、Mullen Foundation、Sarah Campbell Blaffer Endowment in OphthalmologyからYFへの助成金、Baylor College of MedicineへのNIHコア助成金2P30EY002520、およびBaylor College of Medicineの眼科へのResearch to Prevent Blindnessからの無制限の助成金によって支援されました。
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
