Характеристика морфологии сосудов неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации методом ангиографии индоцианином зеленым
Summary
В настоящее время флюоресцентная ангиография (ФА) является предпочтительным методом выявления характера утечки в животных моделях хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ). Однако ФА не дает информации о морфологии сосудов. В этом протоколе описывается использование ангиографии индоцианинового зеленого цвета (ICGA) для характеристики различных типов поражения лазерно-индуцированной ХНВ на мышиных моделях.
Abstract
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной слепоты среди пожилых людей, и ее распространенность быстро растет из-за старения населения. Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) или влажная ВМД, на долю которых приходится 10-20% всех случаев ВМД, ответственна за тревожные 80%-90% слепоты, связанной с ВМД. Современные анти-VEGF-терапии показывают субоптимальный ответ примерно у 50% пациентов. Резистентность к анти-VEGF-терапии у пациентов с ХНВ часто связана с артериолярной ХНВ, в то время как у пациентов, отвечающих на лечение, как правило, наблюдается капиллярная ХНВ. Несмотря на то, что флуоресцеиновая ангиография (ФА) обычно используется для оценки характера утечки у пациентов с влажной ВМД и животных моделей, она не дает информации о морфологии сосудов CNV (артериолярная CNV в сравнении с капиллярной CNV). Этот протокол вводит использование ангиографии индоцианинового зеленого цвета (ICGA) для характеристики типов поражения в лазерно-индуцированных моделях мышей CNV. Этот метод имеет решающее значение для изучения механизмов и стратегий лечения резистентности к анти-VEGF при влажной ВМД. Рекомендуется включать ICGA вместе с ФА для комплексной оценки как негерметичности, так и сосудистых особенностей CNV в механистических и терапевтических исследованиях.
Introduction
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является распространенным заболеванием, которое приводит к тяжелой потере зрения у пожилых людей1. Только в Соединенных Штатах число пациентов с ВМД, по прогнозам, удвоится, достигнув почти 22 миллионов к 2050 году по сравнению с нынешними 11 миллионами. Ожидается, что к 2040 г. во всем мире число случаев ВМД достигнет ошеломляющих 288миллионов2.
Хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ), также известная как «влажная» или неоваскулярная ВМД, может иметь разрушительные последствия для зрения из-за образования аномальных кровеносных сосудов под центральной сетчаткой. Это приводит к кровоизлиянию, экссудации сетчатки и значительной потере зрения. Внедрение терапии антисосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), которые нацелены на внеклеточный VEGF, произвело революцию в лечении CNV. Однако, несмотря на эти достижения, до 50% пациентов демонстрируют неоптимальную реакцию на эти методы лечения, с продолжающейся активностью заболевания, такой как накопление жидкости и неразрешенные или новые кровотечения 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Клинические исследования показали, что резистентность к анти-VEGF у пациентов с ХНВ часто соответствует наличию артериолярной ХНВ, характеризующейся ветвящимися артериолами большого калибра, сосудистыми петлями и анастомотическими соединениями9. Повторное лечение анти-VEGF может способствовать аномалии сосудов, развитию артериолярной CNV и, в конечном счете, резистентности к анти-VEGF-терапии14,15. В случаях артериолярной ХНВ вероятно постоянное подтекание жидкости из-за усиленной экссудации, вызванной неадекватно сформированными плотными соединениями в артериовенозных анастомотических петлях, особенно в условиях высокого кровотока9. И наоборот, люди, которые хорошо реагируют на анти-VEGF-терапию, как правило, демонстрируют капиллярную ХНВ.
В наших исследованиях на животных моделях мы продемонстрировали, что лазерно-индуцированная CNV у пожилых мышей развивает артериолярную CNV и проявляет устойчивость к анти-VEGFтерапии 16,17. И наоборот, лазер-индуцированная CNV у молодых мышей приводит к развитию капиллярной CNV и высокой чувствительности к анти-VEGF-терапии. Таким образом, крайне важно различать сосудистые типы ХНВ как для механистических, так и для терапевтических исследований.
В клинических условиях ХНВ обычно классифицируется на основе характера утечки флуоресцеиновой ангиографии (ФА) (например, тип 1, тип 2), в которой используется флуоресцеиновый краситель для отслеживания экссудации и выявления областей патологической утечки. В исследованиях ВМД CNV преимущественно изучается с использованием ФА на животных моделях. Тем не менее, ФА не позволяет выявить сосудистую морфологию CNV. Более того, ФА захватывает изображения только в видимом спектре света и не может визуализировать сосудистую сеть хориоидеи под пигментным эпителием сетчатки (РПЭ). Напротив, индоцианиновый зеленый (ICG), который проявляет сильное сродство к белкам плазмы, способствует преимущественной внутрисосудистой задержке и позволяет визуализировать сосудистую структуру и кровоток9. Используя свойство флуоресценции ICG в ближнем инфракрасном диапазоне, становится возможным визуализировать пигмент сетчатки и хориоидеи с помощью ангиографии ICG (ICGA). В этом контексте представлен протокол, сочетающий ФА и ICGA для исследования утечки и морфологии сосудов лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у молодых и старых мышей, где наблюдаются капиллярная и артериолярная CNV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование продемонстрировало использование ангиографии индоцианинового зеленого цвета (ICGA) для определения морфологии сосудов артериолярной и капиллярной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) на мышиных моделях с лазерно-индуцированной CNV. Связанные с гемоглобином и инфракра?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от BrightFocus Foundation, Retina Research Foundation, Mullen Foundation и Фонда Сары Кэмпбелл Блаффер в области офтальмологии для YF, основным грантом NIH 2P30EY002520 для Медицинского колледжа Бэйлора и неограниченным грантом для кафедры офтальмологии Медицинского колледжа Бэйлора от Research to Prevention Blindness.
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
