Procédé efficace et reproductible de production de plantes composites par transformation racinaire velue basée sur Agrobacterium rhizogenes
Summary
Ici, nous fournissons le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire des plantes composites.
Abstract
La production de plantes composites avec des racines transgéniques et des tiges et bourgeons non transgéniques en utilisant la transformation racinaire poilue médiée par Agrobacterium rhizogenes est un outil puissant pour étudier la biologie liée aux racines. La transformation des racines velues est établie dans une large gamme de dicotylédons et chez plusieurs espèces de monocotylédones et est presque indépendante du génotype. La méthode traditionnelle d’injection d’hypocotyle avec A. rhizogenes pour obtenir des plantes composites est inefficace, longue, laborieuse et provoque fréquemment la mort de plantes hypocotyles tendres et minuscules. Une transformation très efficace des racines velues en une étape médiée par A. rhizogenes a été établie précédemment, ce qui élimine le besoin de transplantation après la production de racines velues. Dans cette étude, un hypocotyle partiel et une racine primaire ont été enlevés, le site d’incision de l’hypocotyle a été recouvert d’A. rhizogenes, puis les hypocotyles ont été plantés dans de la vermiculite stérile. Après 12 jours de culture, l’incision de l’hypocotyle s’est élargie et de nouvelles racines velues ont été induites. Cet article fournit le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par A. rhizogenes, dont l’efficacité a été démontrée par la production de plantes composites de soja sauvage, de Solanum americanum et de citrouille.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes est une bactérie du sol à Gram négatif de la famille des Rhizobiaceae. A. rhizogenes peut infecter presque tous les dicotylédones, quelques monocotylédones et les gymnospermes individuels par des plaies, produisant des racines velues chez les plantes infectées. La bactérie porte le plasmide Ri (inducteur racinaire), et l’ADN-T du plasmide Ri porte le gène de synthèse opine et les gènes rol (gènes du locus racinaire). Après que l’ADN-T du plasmide Ri pénètre dans une cellule végétale et est intégré dans un chromosome hôte, l’expression des gènes rol induit la production de racines velues1. Un vecteur d’expression binaire végétale portant un gène cible est transformé en A. rhizogenes, et l’A. rhizogenes transformé est utilisé pour infecter une plante. Les racines transgéniques peuvent être induites dans les plantes infectées, produisant des plantes composites contenant des racines transgéniques et des tiges et bourgeons non transgéniques. Généralement, une plante composite peut être obtenue dans les 14-20 jours. La transformation racinaire poilue médiée par A. rhizogenes n’est généralement pas limitée par le génotype chez les plantes dicotylédones2. Les racines velues produites par les plantes infectées par A. rhizogenes se caractérisent par un taux de croissance rapide, un héritage stable et une utilisation facile. La transformation racinaire velue médiée par A. rhizogenes est actuellement largement utilisée pour étudier la biologie liée aux racines. En outre, la transformation des racines velues peut également être utilisée pour valider et optimiser l’efficacité de l’édition de la cible du système CRISPR / Cas9 3,4,5 et de la localisation subcellulaire des protéines. Par conséquent, la transformation des racines velues est un outil important dans la recherche sur la fonction des gènes des plantes, l’ingénierie métabolique et les interactions entre les racines et les microorganismes de la rhizosphère 6,7,8.
Les plantes composites contenant des racines transgéniques obtenues par transformation de racines velues ont été largement produites chez les plantes dicotylédones, en particulier dans les légumineuses. La méthode traditionnelle d’injection de l’hypocotyle avec A. rhizogenes a été utilisée pour produire Lotus corniculatus9, soja 10, tomate11, patates douces12 et de nombreuses autres plantes 5,8. La méthode d’injection d’hypocotyle est inefficace et est susceptible de causer la mort de plantes hypocotyles jeunes ou minuscules. Par conséquent, la méthode a été améliorée en coupant les racines embryonnaires, en recouvrant l’incision des plantules d’A. rhizogenes, puis en plaçant l’hypocotyle sur un milieu de culture stérile pour la culture enracinaire13. Cependant, ces étapes sont effectuées dans un environnement stérile et les étapes de l’opération sont relativement lourdes. En particulier, les plantes composites résultantes doivent être transplantées, ce qui augmente la quantité de travail. Dans des travaux antérieurs, une transformation racinaire velue en une étape médiée par A. rhizogenes (ARM) a été établie dans le concombre, le soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula et la tomate 2,14,15,16,17. La racine primaire et l’hypocotyle partiel ont été enlevés, le site d’incision de l’hypocotyle restant a été recouvert d’A. rhizogenes transformé, et le semis a ensuite été planté dans de la vermiculite humide stérile. Après 12 jours de culture, des racines poilues ont été produites sur le site d’incision. La méthode ARM en une étape est très efficace et nécessite moins de temps pour produire des racines velues. Le repiquage après la formation de racines poilues n’est pas non plus nécessaire. Parce que la contamination microbienne peut être évitée sans transplantation, la méthode ARM en une étape peut être particulièrement utile pour étudier les interactions entre les plantes et les micro-organismes, telles que la fixation symbiotique de l’azote entre les légumineuses et Rhizobia, et les symbioses entre les plantes et les champignons mycorhiziens arbusculaires. Dans cet article, un protocole détaillé de transformation des racines velues médiée par A. rhizogenes en une étape est fourni avec des exemples de plantes composites produites dans le soja sauvage, Solanum americanum et la citrouille. Avec le protocole, les chercheurs peuvent effectuer en douceur la transformation ARM en une étape.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode à racine velue médiée par A. rhizogenes en une étape est une méthode plus simple et plus efficace pour produire des plantes composites que la méthode d’injection d’hypocotyle. La méthode ARM en une étape améliore considérablement l’efficacité de la transformation des racines velues, raccourcit le temps de production des racines velues, augmente le nombre de racines velues et réduit la quantité de travail impliquée. Le protocole de transformation amélioré est optimal pour les ét…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche de l’Université de Liaocheng (318012028) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
